Une nouvelle approche pour l'analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur<sup> 15</sup> N Marquage métabolique et spectrométrie de masse quantitative
Summary
L'approche décrite comparative, protéomique quantitative vise à obtenir un aperçu de la composition de complexes multiprotéiques dans des conditions différentes et est démontrée en comparant différentes souches génétiquement. Pour l'analyse quantitative des volumes égaux de fractions différentes d'un gradient de densité de saccharose sont mélangés et analysés par spectrométrie de masse.
Abstract
Le protocole mis en place un outil pour l'analyse des complexes multiprotéiques dans la membrane des thylakoïdes, en révélant un aperçu de la composition complexe dans des conditions différentes. Dans ce protocole, l'approche est démontrée en comparant la composition de la protéine complexe responsable de flux d'électrons cyclique (CEF) dans Chlamydomonas reinhardtii, isolé à partir de différentes souches génétiquement. Le procédé comprend l'isolement de membranes thylacoïdes, suivi de leur séparation dans des complexes multiprotéiques par le saccharose centrifugation à gradient de densité, SDS-PAGE, immunodétection et comparative, la spectrométrie de masse quantitative (MS) sur la base de marquage métabolique différentiel (14 N / 15 N) de l' souches analysées. Membranes thylacoïdes solubilisées détergents sont chargés sur des gradients de densité de saccharose à une concentration de chlorophylle égal. Après ultracentrifugation, les gradients sont séparées en fractions, qui sont analysés en masse-spectrometry basé sur le volume égal. Cette approche permet l'étude de la composition dans les fractions de gradient, les analyser le comportement de migration des protéines différentes, notamment en se concentrant sur ANR1, CAS, et PGRL1. De plus, cette méthode est démontrée en confirmant les résultats immuno et, en outre, en soutenant les conclusions des études précédentes (l'identification et la migration de PSI-dépendante des protéines qui ont été précédemment décrits comme faisant partie de la FEC-supercomplexe comme PGRL1, FNR, et cyt f). Notamment, cette approche est applicable à traiter un large éventail de questions pour lesquelles ce protocole peut être adopté et utilisé par exemple pour des analyses comparatives de composition complexe multiprotéique isolé des conditions environnementales distinctes.
Introduction
processus de photosynthèse dans les membranes des thylakoïdes de plantes et d'algues peuvent fonctionner en mode linéaire et cyclique. Au cours de l'écoulement linéaire d'électrons (LEF) de photosystème I (PSI), photosystème II (PSII) et le cytochrome b 6 / f finalement transférer des électrons de l'eau à NADP + 1, conduisant à la génération de NADPH et ATP 2. En revanche, le flux d'électrons cyclique (CEC), qui est connu pour être induit dans des conditions d'environnement variées telles que des conditions d'état 2 3 et anaérobies 4, les résultats de la re-réduction de l'ISP oxydé par l'injection d'électrons dans la chaîne de transport d'électrons. Ce processus peut avoir lieu soit sur le côté du stroma de la cytochrome b 6 / f complexe 1 ou à la piscine de plastoquinone 5 et génère de l'ATP, mais pas de la NADPH 2.
L'objectif du protocole est de démontrer présenté une spectrométrie de masse (MS) sur la base de méthode pour l'analyse comparative, quantitative des complexes multiprotéiques dans les membranes des thylakoïdes de Chlamydomonas reinhardtii de mieux comprendre la composition de ces complexes dans des conditions différentes (illustrés en comparant différentes souches génétiquement). Cette approche a été appliquée dans une publication de Terashima et al., En 2012 montrant une Ca 2 + régulation dépendant de CEF dans C. reinhardtii médiée par un complexe multiprotéique comprenant les protéines CAS, ANR1, et PGRL1 6. La procédure sera expliquée par analyse comparative de la composition de la CEC-supercomplexe dans deux souches génétiquement différentes, profitant ainsi de l'étiquetage une des deux souches avec de l'azote lourd (15 N). Brièvement, le protocole comprend la préparation de membranes thylacoïdes, suivie d'une solubilisation du détergent et le fractionnement de complexes photosynthétiques dans un gradient de densité de saccharose. Après fractionnement du gradient, choisi fractions de deux souches sont mélangées à base de volume égal, séparées par SDS-PAGE suivie d'une digestion in-gel et l'analyse quantitative subséquente de la sclérose en plaques.
Comme mentionné ci-dessus, CEF est induite dans différentes conditions environnementales et une publication à partir de 2010 démontre l'isolement d'un CEF-supercomplexe fonctionnelle de l'état 2 cellules verrouillées de C. reinhardtii 7, qui a été réalisée par des membranes de séparation thylacoïdiennes solubilisées sur un gradient de densité de sucrose pendant ultracentrifugation. Différent de Iwai et al. 7, le protocole présenté décrit l'isolement de la CEC-supercomplexe cultivé en anaérobiose à partir de C. cultures reinhardtii en suivant une procédure alternative. Celui-ci comprend des changements dans le protocole d'isolement thylacoïdes ainsi que les différences concernant l'étape de solubilisation et la séparation des complexes protéiques par ultracentrifugation. Dans le présent protocole, les membranes des thylakoïdessont isolées en appliquant le mode opératoire publié par Chua et Bennoun 8, tandis que les tampons utilisés pour la préparation des thylakoïdes par Iwai et al. contenue 25 Mes mM, 0,33 M de saccharose, 5 mM de MgCl2, NaCl 1,5 mM (pH 6,5) comme décrit 9. La solubilisation a été effectuée avec de 0,7 à 0,8% de détergent (n-tridécyl-β-D-maltoside) pendant 30 min sur de la glace dans le cas d'Iwai et collaborateurs, tandis que la méthode de solubilisation décrit ici repose sur l'utilisation de 0,9% de détergent (n -dodécyl-β-D-maltoside (β-DM)) et est effectuée pour seulement 20 min sur la glace. Les deux groupes ont utilisé 0,8 mg de chlorophylle par ml pour la solubilisation avec le détergent respectif. Pour la séparation de complexes à partir de membranes photosynthétiques des thylacoïdes solubilisées Iwai et al. Appliqué entre les concentrations de saccharose de 0,1 à 1,3 M, tandis que les auteurs de ce protocole utilise des concentrations allant de 0,4 à 1,3 M. La dernière différence est la vitesse de centrifugation, ce qui est faible par rapport à l'eapublication rlier.
Solubilisation des membranes thylacoïdes avec des détergents non ioniques suivie d'un fractionnement gradient de densité de saccharose a déjà été utilisée dans de nombreuses études, allant des années 1980 jusqu'à aujourd'hui, 7, 9 à 14 et également à l'application de marquage métabolique des protéines est un procédé très répandu dans le domaine de la protéomique. La méthode décrite s'applique à l'étiquetage 15 N métabolique pour l'une des deux souches comparées par la mise en culture en présence d'azote lourd comme seule source d'azote sous la forme de 15 N NH 4 Cl, qui est incorporée dans tous les acides aminés conduisant à une masse décaler en fonction de la séquence d'acides aminés du peptide. Lors de l'analyse d'un mélange de 14 N et 15 N à l'intérieur une MS exécuté, ce changement de masse peut être utilisée pour déterminer l'origine de l'échantillon pour chaque peptide et le peptide parent abondances peuvent être calculées représentant les abondances relatives pour l'correspondentment 15 protéine.
De nombreuses études protéomiques quantitatives sur C. reinhardtii sont disponibles, qui permettent de comparer une quantité définie de protéines pour analyser les changements dans le protéome entre les conditions expérimentales (par exemple, les changements dans le protéome en raison de nutriments 16-19 ou lumière le stress 20,21). Par rapport à ces études, l'approche a présenté des volumes égaux d'échantillons sont combinés et analysés. Cette configuration permet d'étudier le comportement de migration des protéines dans le gradient et en outre à analyser la composition des différents complexes en ce qui concerne les souches étudiées.
Cette méthode sera expliquée en se concentrant principalement sur trois protéines: Le premier candidat est la protéine de capteur calcium CAS chloroplastique-localisé, qui a été montré être impliqué dans le photo-acclimatation en C. reinhardtii 22. Le calcium est considéré comme un signal importantment ion pour les voies qui sont activés en raison de différentes contraintes biotiques et abiotiques conduisant finalement à des changements dans l'expression des gènes et la physiologie des cellules 23 et il a été proposé que les chloroplastes pourraient contribuer à Ca 2 + cellulaire signalisation via la protéine CAS 22,24,25. La seconde protéine est ANR1 (réponse anaérobie 1 6), une protéine qui a été montré être induite dans des conditions anoxiques dans la croissance de C. reinhardtii 26. Notamment, CAS ainsi que ANR1 ont été identifiés comme sous-unités du CEF-supercomplexe et ailleurs, en utilisant des approches de génétique inverse, il a été démontré que les deux protéines contribuent fonctionnellement au CEF in vivo 6, en soutenant leur rôle en tant que sous-unités fonctionnelles de ce complexe protéique. La troisième protéine est la protéine thylakoid PGR5-Like 1 (PGRL1), qui a été montré pour être impliqués dans le CECR dans Chlamydomonas 4,27 ainsi que chez Arabidopsis 5,28 et était aussi identified dans le travail de Iwai et al. 7
Cette approche sera présentée en montrant les résultats de deux expériences différentes: type sauvage (WT) versus (vs) une souche ΔPSI 29, présentant une délétion du gène du CCSP, codant pour une sous-unité du photosystème essentiel je, qui fait également partie de la CEF-supercomplexe et WT vs un pgrl1 knock-out souche 4. Pour chacune de ces expériences, la composition quantitative de la CEC-supercomplexe entre un N-15 et une souche 14 N-marqué a été comparé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Différentes études protéomiques quantitatives utilisant stable marquage isotopique ont été publiées dans les dernières années. Dans ces expériences, généralement de deux échantillons différents sont comparés, dont un échantillon est marqué avec un isotope stable. Par la suite, des protéines ou des peptides à partir des deux échantillons sont combinés dans un rapport égal, et en outre 48 traitées ensemble. Ces études ont l'intention souvent comparer compartiments définis isolés cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MH reconnaît le soutien de la «Deutsche Forschungsgemeinschaft» (DFG). Auteur contributions: MH conçu recherche; KT, JS et MT a effectué des recherches et a analysé les données; KT et MH a écrit le papier.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0662 | |
| Acetone | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2300 | |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
9340 | harmful, work with gloves see protocol text for further precautions |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
39466-62-1 | |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0988 | |
| Ammonium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3583 | |
| Ammonium sulfate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3598 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
10041653 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0819 | |
| EDTA | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2937 | |
| Formic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3858 | |
| Hepes | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3724 | |
| Magnesium chloride | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A4425 | |
| Methanol | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2954 | |
| Phosphorous acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0989 | |
| Di-Potassium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1042 | |
| Potassium di-hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1043 | |
| Sodium hydroxide | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1551 | |
| Sucrose | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1125 | |
| Tricine | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3954 | |
| Tris | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2264 | |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega website: http://www.promega.de/ |
V5111 | |
| Equipment | |||
| Neboulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 |
||
| Centrifuge tubes (14 x 89 mm) for preparation of takahashi style gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
331372 | |
| Centrifuge tubes 25 x 89 mm for preparation of thylakoid isolation gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
344058 | |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
449/72 | |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
10618242 | |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
105252220 | |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| 기타 | |||
| Antibodies | Agrisera website: http://www.agrisera.com/en/index.html |
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