multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup> 15</sup> N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석
Summary
기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.
Abstract
도입 된 프로토콜은 서로 다른 조건에서 복잡한 구성에 대한 통찰력을 공개함으로써, 틸라코이드 막에서 multiprotein의 단지의 분석을위한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜의 접근 방식은 유 전적으로 서로 다른 계통에서 분리 인 Chlamydomonas reinhardtii의 순환 전자 흐름 (CEF), 복잡한 책임 단백질의 구성을 비교하여 보여줍니다. 절차의 차동 대사 라벨링 (14 N / 15 N)에 근거 자당 밀도 구배 원심 분리, SDS-PAGE, 면역 및 비교 정량적 질량 분석 (MS)에 의해 multiprotein의 착물에 자신 분액하여 틸라코이드 막 분리를 포함 분석 변종. 세제 용해 틸라코이드 막은 동일한 엽록소 농도에서 자당 밀도 구배에로드됩니다. 초 원심 분리 한 후, 그라데이션은 대량 spectromet으로 분석 분획으로 분리된다공예 같은 부피에 따라. 이 접근법은 또한 구배 분획 내의 조성물의 조사 및 특히 ANR1, CAS 및 PGRL1에 집중 다른 단백질의 마이그레이션 동작을 분석 할 수있다. 또한,이 방법은 (이전의 연구에서 이전에 같은 PGRL1, FNR과 CEF-supercomplex의 일부가 설명 된 단백질의 식별 및 PSI에 의존하는 이주 연구 결과를 지원에 의해 면역 블롯과 부가 적 결과를 확인하여 설명된다 CYT F). 특히,이 방법은이 프로토콜을 채용 할 수 있고, 예를 들면 별개의 환경 조건으로부터 격리 multiprotein의 복합 조성물의 비교 분석을 위해 사용되는 질문의 광범위한 주소에 적용 가능하다.
Introduction
식물과 조류의 틸라코이드 막에서 광합성 과정은 선형 및 순환 모드에서 작동 할 수 있습니다. 선형 전자 흐름 (LEF) 광계 I (PSI), 광계 II (PSII)와 시토크롬 B 6 / F 동안 궁극적으로 NADPH와 ATP의 2 세대로 이어지는 물에서 NADP + 1에 전자를 전송할 수 있습니다. 반대로, 상태 2 및 혐기성 조건 04 위로 전자 수송 체인에 전자를 주입하여 산화 PSI의 재 환원의 결과와 같은 다양한 환경 조건에서 유발되는 것으로 알려져있다 환상 전자 흐름 (CEF). 이 과정은 시토크롬 B 6 / F 복합체 1의 기질면에서 또는 플라 스토 퀴논 풀 5시에 하나 자리를 대신하고 ATP를 생성하지만 NADPH 2 수 있습니다.
제시된 프로토콜의 목적은 질량 분석계 (MS) 기반 m을 입증하는 것이다(유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 예시) 다른 조건이 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻을 수 인 Chlamydomonas reinhardtii의 틸라코이드 막에서 multiprotein의 단지의 비교, 정량 분석을위한 ethod. 이 방법은 테라지마 외 의해 출판물에 적용되었다. 2012 년 C.에 CEF의 칼슘 2 +에 의존 규제를 보여주는 단백질 CAS, ANR1 및 PGRL1 6를 포함하는 multiprotein의 복합에 의해 매개 reinhardtii. 절차는 비교적함으로써 라벨링 무거운 질소 (N 15)와 두 균주 중 하나를 이용하고,이 유 전적으로 상이한 균주에서 CEF-supercomplex의 조성물을 분석하여 설명한다. 간략하게, 프로토콜은 세제 가용화 및 자당 밀도 구배에서 광합성 착체 분획 하였다 틸라코이드 막의 제조를 포함한다. 그라데이션의 분별 한 후, 골절을 선택두 균주의 tions 혼합, 같은 부피에 따라 인 – 젤 소화 이후 양적 MS 분석에 의해 다음 SDS-PAGE에 의해 분리된다.
위에서 언급 한 바와 같이, CEF는 다른 환경 조건에서 유도 된 2010 년에서 게시 상태에서 C. 2 잠긴 셀을 기능 CEF-supercomplex의 분리를 보여줍니다된다 초 원심 동안 자당 밀도 구배에 가용화 틸라코이드 막 분리에 의해 수행 된, 7 reinhardtii. 이와이 등. 7 달리, 제시된 프로토콜은 혐기성 성장 C.에서 CEF-supercomplex의 분리를 설명 다른 절차에 따라 reinhardtii 문화. 이것은 틸라코이드 분리 프로토콜의 변화뿐만 아니라 가용화 단계에 관한 차이와 초 원심 분리에 의해 단백질 복합체의 분리를 포함한다. 본 프로토콜, 틸라코이드 막버퍼가 이와이 등으로 틸라코이드 제조에 사용하면서, Chua의 및 Bennoun (8)에 의해 발표 된 절차를 적용하여 격리하는 알. 9 설명 된대로 25 mM의 메스, 0.33 M 수크로오스, 5 mM의 MgCl2를 1.5 mM의 염화나트륨 (산도 6.5)이 포함되어 있습니다. 여기에 설명 된 가용화 방법은 0.9 %의 세제의 사용에 의존하면서 가용화는, 이와이와 동료의 경우 얼음 위에 30 분 동안 0.7 ~ 0.8 %의 세제 (N-데실-β-D-말토 사이드)를 수행 하였다 (N – 도데 실-β-D-말토 (β-DM)) 및 얼음에 20 분 동안 수행된다. 두 그룹은 각각의 세제로 가용화 ML 당 엽록소의 0.8 MG를 사용했습니다. 이 프로토콜의 저자의 농도 범위를 사용하는 반면 가용화 틸라코이드 막에서 광합성 복합체의 분리를위한 이와이 외., 0.1-1.3 M 사이 수크로오스 농도를 적용 0.4-1.3 M. 마지막 차이로부터 비해 낮다 원심 속도이며, 개에rlier 출판.
자당 밀도 구배 분획 하였다 비이 온성 세제 틸라코이드 막의 가용화 이미 1980 년대부터 또한 단백질의 대사 라벨링 애플리케이션 프로테오믹스 분야에서 널리 방법 오늘 7, 9-14까지 이르는 수많은 연구에 적용되어왔다. 기재된 접근 방법은 대량으로 이어지는 모든 아미노산에 도입되어 15 N NH4Cl 등의 형태로 단독 질소원으로서 무거운 질소의 존재를 배양하여이 비교 균주 중 하나에 대해 15 N 대사 라벨링 적용 펩티드의 아미노산 서열에 따라 시프트. 한 MS는 실행 시간 이내 14 N 15 N의 혼합물을 분석 할 때, 이러한 질량의 변화는 각 펩티드와 존재비는 대응 대해 상대적인 풍부함을 나타내는 계산 될 수 상대 펩타이드 샘플 원점을 결정하는데 사용될 수있다단백질 15을 보내고.
C.에 많은 정량 프로테오믹스 연구 reinhardtii는 실험 조건 (16-19으로 인해 영양소 나 가벼운 스트레스 (20, 21)에 대한 프로테옴의 예를 들어 변경) 사이의 프로테옴의 변화를 분석하는 단백질의 정량 비교하는, 사용할 수 있습니다. 그 연구에 비해, 현재 제시된 방법에 샘플 같은 부피가 결합되고 분석된다. 이 설정은 그라데이션 내에서 단백질의 이동 동작을 연구하고 또 연구 균주에 대한 다른 단지의 구성을 분석 할 수 있습니다.
이 방법은 주로 세 가지 단백질에 집중하여 설명한다 : 첫 번째 후보는 C.에 사진 순응에 관여하는 것으로 나타났다 엽록체 지역화 칼슘 센서 단백질 CAS입니다 reinhardtii 22. 칼슘은 중요한 신호로 간주됩니다마지막으로 유전자 발현 및 세포 생리학 23의 변화에 선도적으로 인해 다른 생물과 비 생물 적 스트레스에 활성화되고,이 엽록체가 CAS 단백질 22,24,25를 통해 신호 + 세포의 칼슘에 기여할 수 있음을 제안 된 경로에 이온을 주입. 두 번째 단백질은 ANR1 (혐기성 반응 1 6), C.에서 무산소 성장 조건에서 유도 표시했다 단백질이다 reinhardtii 26. 특히, CAS 등 ANR1은 CEF-supercomplex 더욱이, 역방향 유전자 접근법을 사용함으로써,이 두 단백질이 단백질 복합체의 기능적 서브 유니트로서의 역할을지지 생체 6 CEF 기능적 올릴 것을 증명 하였다 소단위로 확인 하였다. 세 번째 단백질은 클라 미도 모나스 4,27뿐만 아니라 애기 장대 5,28에 CEF에 참여하는 것으로도 ID이었다 틸라코이드 단백질 PGR5 – 드 1 (PGRL1)입니다이와이 외 여러분의 작업에 entified. 7
, 야생형 (WT) (대) ΔPSI 29 균주 대 psab 유전자의 삭제를 나타내는도의 일부입니다 제가 소단위 필수 광계, 코딩 :이 방법은 두 가지 실험의 결과를 표시하여 표시됩니다 CEF-supercomplex 및 WT 대 pgrl1 노크 아웃 변형 4. 그 실험의 각 15 N과 14 N-라는 변형을 비교 한 사이의 CEF-supercomplex의 양적 구성.
Protocol
Representative Results
Discussion
안정 동위 원소 표지를 사용하여 다른 정량 프로테오믹스 연구는 지난 몇 년에 출판되었다. 이 실험에서 일반적으로 두 개의 서로 다른 샘플을 하나의 샘플이 안정 동위 원소로 표지 된의, 비교됩니다. 그 후 두 샘플에서 단백질이나 펩티드는 동일한 비율로 결합되어 더욱 함께 48 가공. 이러한 연구들은 조사를 위해 다른 스트레스 조건 26,34,49에 노출 된 정의 고립 된 세포 구?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MH는 "도이치 Forschungsgemeinschaft"(DFG)의 지원을 인정합니다. 저자 공헌 : MH 연구 설계, KT, JS 및 MT 연구를 수행하고 데이터를 분석, KT와 MH는 종이를 썼습니다.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0662 | |
| Acetone | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2300 | |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
9340 | harmful, work with gloves see protocol text for further precautions |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
39466-62-1 | |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0988 | |
| Ammonium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3583 | |
| Ammonium sulfate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3598 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
10041653 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0819 | |
| EDTA | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2937 | |
| Formic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3858 | |
| Hepes | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3724 | |
| Magnesium chloride | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A4425 | |
| Methanol | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2954 | |
| Phosphorous acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0989 | |
| Di-Potassium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1042 | |
| Potassium di-hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1043 | |
| Sodium hydroxide | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1551 | |
| Sucrose | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1125 | |
| Tricine | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3954 | |
| Tris | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2264 | |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega website: http://www.promega.de/ |
V5111 | |
| Equipment | |||
| Neboulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 |
||
| Centrifuge tubes (14 x 89 mm) for preparation of takahashi style gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
331372 | |
| Centrifuge tubes 25 x 89 mm for preparation of thylakoid isolation gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
344058 | |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
449/72 | |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
10618242 | |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
105252220 | |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| 기타 | |||
| Antibodies | Agrisera website: http://www.agrisera.com/en/index.html |
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