التعبير عن المؤتلف وظيفية راصة دموية والبروتينات النورامينيداز من الفيروسات الأنفلونزا H7N9 رواية باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية
Summary
نحن هنا تصف طريقة للتعبير عن مستضدات سطح فيروس الانفلونزا مطوية بشكل صحيح وظيفية المستمدة من فيروس H7N9 الصينية الرواية في خلايا الحشرات. تقنية يمكن تكييفها للتعبير عن ectodomains من أي البروتينات السطحية الفيروسية أو الخلوية.
Abstract
نظام التعبير الفيروسة العصوية هو أداة قوية للتعبير عن البروتينات المؤتلف. نحن هنا استخدامه لإنتاج نسخ مطوية بشكل صحيح والغليكوزيلاتي من الأنفلونزا فيروس بروتين السطح – على راصة دموية (HA) والنورامينيداز (NA). كمثال على ذلك، اخترنا HA و NA البروتينات التي أعرب عنها فيروس H7N9 الرواية التي ظهرت مؤخرا في الصين. ومع ذلك البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لHA و NA البروتينات التي أعربت عنها أي الأنفلونزا الأخرى وسلالات الفيروس (ب). المؤتلف HA (رحه) وNA (RNA) والبروتينات هي الكواشف هامة لفحوصات المناعية مثل ELISA ELISPOT و، وأيضا في استخدام واسع لتوحيد اللقاح، واكتشاف الأجسام المضادة، والعزلة وتوصيف. علاوة على ذلك، جزيئات NA المؤتلف يمكن استخدامها للكشف عن مثبطات جزيء صغير ومفيدة لتوصيف وظيفة الأنزيمية للNA، وكذلك حساسيتها للمضادات الفيروسات. البروتينات HA المؤتلف أيضا باياختبار لقاحات تجريبية نانوغرام في النماذج الحيوانية، وتم الترخيص لقاح استنادا المؤتلف HA مؤخرا من قبل ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام في البشر. طريقة وصفنا هنا لإنتاج هذه الجزيئات هو مستقيم إلى الأمام، ويمكن أن تسهل البحث في مختبرات الأنفلونزا، نظرا لأنه يسمح لإنتاج كميات كبيرة من البروتينات بسرعة وبتكلفة منخفضة. على الرغم من هنا ونحن نركز على بروتينات سكرية سطح فيروس الانفلونزا، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لإنتاج غيرها من البروتينات السطحية الفيروسية والخلوية.
Introduction
كرد فعل أول من ظهور الأخيرة من إنفلونزا H7N9 سلالة الفيروس رواية في الصين، ونحن اكتسبت البلازميدات تحمل تسلسل الجيني لراصة دموية (HA) والنورامينيداز (NA) جينات العزلات الأولين. باستخدام هذه البلازميدات كنا قادرين على بناء ناقلات التعبير baculoviral بسرعة لإنتاج المؤتلف HA و NA في خلايا الحشرات. تم تأسيس هذا النظام التعبير بشكل جيد في مختبرنا وأثبتت محوريا في العديد من مشاريعنا البحثية الجارية 1-8. خلايا الحشرات قادرون على أضعاف بشكل صحيح وبعد translationally تعديل البروتينات المعقدة. وتشمل هذه التعديلات ارتباط بالغليكوزيل N-مرتبط، وهو أمر مهم بالنسبة للعديد من البروتينات السكرية الفيروسية. على هذا النحو، فإنه ليس من المستغرب أن نظام الفيروسة العصوية يتم تأسيس جدا للتعبير عن مستضدات سطح فيروس الأنفلونزا. في الواقع، فإن العديد من هياكل الكريستال HA و NA تم حلها باستخدام الخلايا أعرب بروتينات الحشرات 9-11. ميزة أخرى للالنظام تكمن في موثوق عوائد عالية من البروتين تصل إلى 30 ملغ من خلية ثقافة HA / L (بناء على خبرتنا مع أكثر من 50 البروتينات HA مختلفة) – نتيجة لفيروس العدوى التعبير طردوا من المروج polyhedrin قوية.
إزالة الغشاء وendodomain من HA و NA البروتينات يسمح للتعبير عن الإصدارات secretable قابلة للذوبان من البروتينات، وبالتالي يسهل كثيرا من عملية تنقية. بالإضافة إلى ذلك، هذه ectodomains يتم hexahistidine الموسومة، وبالتالي يمكن تنقيتها باستخدام تقارب اللوني باستخدام ني 2 + الراتنج. المجالات عبر الغشاء من HA و NA البروتينات تسهم في homotrimer وتشكيل homotetramer، على التوالي. من أجل الحفاظ على هذه oligomerizations، ونحن إضافة trimerization المجال C محطة لHA-، وtetramerization المجال-N محطة ليبني NA (الشكل 1). أظهرنا بشكل قاطع أن هذا المجال trimerization استقرار وظيفي، العواقبrved الحواتم بتكوين على ساق المجال من HA 1. وtetramerization الصحيح للNA قد تسهم أيضا في تصحيح للطي وظيفة NA 10. يمكن طلب متواليات وناقلات baculo نقل إيواء trimerization أو tetramerization المجالات من المؤلفين أو من غيرها من المختبرات في هذا المجال، 9،10،12.
مسألة هامة أخرى للتعبير عن البروتينات في الخلايا تفرز الحشرة هو اختيار خط الخلية اليمنى. بينما تستمد ورق القطن frugiperda خلايا Sf9 الفيروسة العصوية دعم النسخ المتماثل بشكل جيد للغاية، وتستخدم عموما لإنقاذ الفيروس وانتشار، فقد القدرة على إفراز كميات كبيرة من البروتين محدودة. المستمدة Trichoplusia ني BTI-TN-5B1-4 خلايا (المعروف باسم ارتفاع خمسة) لديها قدرة أعلى وإفراز هي خط خلية من خيار للتعبير في هذا البروتوكول 13،14. وعلاوة على ذلك، فإنه من المفيد لخفض أو حتى إزالة مصل بقري جنيني (الفيس بوكS) من ثقافات التعبير. لذا فإننا استخدام وسائل الإعلام مع انخفاض (3٪) المحتويات FBS لنمو مخزونات فيروس العمل، ونحن أداء التعبير البروتين في وسائل الإعلام الحرة في المصل.
وتستخدم المؤتلف HA و NA البروتينات المناعية لكثير من التقنيات. ربما كان أكثرها شيوعا هو في فحوصات ELISA لقياس تحويل مصل التطعيم على في البشر أو الحيوانات 4،6،7،15. وقد وتستخدم أيضا الوافدين الجدد في المقايسات ELISPOT على حد سواء جزيئات تنشيطية والكواشف كشف عن الأجسام المضادة إفراز الخلايا 16. استخدامهم الطعوم الجزيئية تسمح لفرز خصيصا لplasmablasts أو أنواع أخرى من الخلايا البائية التي يمكن استخدامها لعزل (العلاجية) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS). وكذلك تستخدم المؤتلف HA و NA الجزيئات في توصيف هذه MABS 8. ومن الأمثلة الأخرى دراسة استقرار درجة الحموضة أو مستقبلات خصوصية قد أعربت عنها عزلات فيروس مختلفة، أو تقييم كمي NA الأنزيمية محددةالنشاط أو مقاومة للمثبطات. علاوة على ذلك، المؤتلف، HA تنقيته يمكن استخدامها لتوحيد المحتوى HA لقاحات فيروس الأنفلونزا المعطل.
الأهم من ذلك، رحه (وإلى درجة معينة NA) ويجري حاليا اختبار اللقاحات المرشحة في النماذج الحيوانية وتجارب اكلينيكية على البشر مع المرشح لقاح واحد يجري ومرخصة من قبل ادارة الاغذية والعقاقير في عام 2013 2،17-19. في الاستفادة من هذه اللقاحات الرواية هو أنه، نظرا لطبيعة المؤتلف من هذه البروتينات، يمكن تجنب عملية كثيفة العمالة من توليد النمو المرتفع الفيروسات المتفارز. ربما أكثر أهمية هو حقيقة أن العائد HA لاعبيها عالية واستنساخه من سلالة إلى سلالة. أيضا، منذ ويتم إنتاج هذه اللقاحات في نظام خالية من البيض، وأنها لا تحتوي على الملوثات البروتين التي هي مشكلة بالنسبة للأشخاص الذين يعانون من الحساسية البيض.
نحن هنا اختار للتعبير عن HA و NA البروتينات من العزلات اثنين من الصينيين فيروس الانفلونزا H7N9 الرواية، A / آنهui/1/13 وA/Shanghai/1/13 20،21. هذه أمثلة في الوقت المناسب، ولكن وصفها بروتوكول يمكن استخدامها للتعبير عن أي وباء الأنفلونزا A HA NA أو البروتينات ويمكن تكييفها للتعبير عن أي البروتينات الفيروسية أو الخلوية يفرز الأخرى. يمكن استنساخ البروتينات عبر الغشاء مثلوثي أو رباعي القسيمات في أشرطة التعبير المستخدم لHA و NA، على التوالي. ومع ذلك، يفرز معظم البروتينات الخلوية القابلة للذوبان، مثل إنترفيرون على سبيل المثال، لا تحتاج إلى مجال إضافية لتحقيق الاستقرار ويمكن التعبير عنها فقط مع علامة hexahistidine-C المحطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن التعبير عن فيروس الأنفلونزا HA و NA البروتينات في خلايا الحشرات باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية عموما على التوالي إلى الأمام، وهناك العديد من النقاط الهامة للنظر فيها. من المهم، كما أشار في المقدمة، أن يتم التعبير عن ectodomains من HA و NA في الانصهار مع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر باتريك ويلسون لريتوكسيماب CR9114. نشكر أيضا جنيفر Debeauchamp وريتشارد ويبي لالبلازميدات A/Anhui/1/13 الأصلي. تم تقديم الدعم الجزئي لهذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التي تمولها مشروع برنامج منح AI097092-01A1 وCEIRS (مراكز التميز للبحوث الأنفلونزا ومراقبة، HHSN26620070010C). وأيد FK من قبل اروين شرودنجر الزمالة (J 3232) من صندوق العلوم النمساوية (FWF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
