여기에서 우리는 곤충 세포에 새로운 중국어 H7N9 바이러스에서 파생 제대로 접혀 기능 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 표현하는 방법에 대해 설명합니다. 기술은 어떤 바이러스 성 또는 세포 표면 단백질의 ectodomains을 표현하도록 할 수있다.
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방법 논문
배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현
이 논문에서
요약
초록
배큘로 바이러스 발현 시스템은 재조합 단백질의 발현을위한 강력한 도구이다. 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 아제 (NA) - 여기서 우리는 독감의 제대로 접어 당화 버전의 바이러스 표면 당 단백질을 생산하기 위해 사용합니다. 예를 들어, 우리는 최근 중국에서 출현 한 새로운 H7N9 바이러스에 의해 표현 된 HA 및 NA 단백질을 선택했다. 그러나 프로토콜은 쉽게 다른 인플루엔자 및 B 바이러스 균주에 의해 발현 HA 및 NA 단백질을 위해 적응 될 수있다. 재조합 HA (RHA)와 NA (RNA) 단백질은 ELISPOT 및 ELISA와 같은 면역 학적 분석을위한 중요한 시약, 그리고 백신 표준화, 항체 발견, 분리 및 특성 분석을위한 다양한 프로그램도 사용합니다. 또한, 재조합 NA 분자는 작은 분자 억제제에 대한 화면으로 사용하고 NA의 효소 기능의 특성뿐만 아니라, 항 바이러스제에 대한 민감도에 유용하다 할 수있다. 재조합 HA 단백질은 또한 바이 아르NG는 동물 모델에서 실험적인 백신으로, 테스트 및 재조합 HA 기반의 백신은 최근에 인간에 사용하기 위해 FDA에 의해 허가했다. 그것은 빠르고 저렴한 비용으로 단백질의 대량 생산이 가능하기 때문에 우리는이 분자를 생산하기 위해 여기에 설명하는 방법은, 곧장 앞으로 인플루엔자 실험실에서 연구를 촉진 할 수 있습니다. 우리는 인플루엔자 바이러스의 표면 당 단백질에 초점 여기 있지만,이 방법은 또한 다른 바이러스 및 세포 표면 단백질을 생산하는 데 사용될 수있다.
서론
중국에서 새로운 H7N9 인플루엔자 바이러스 균주의 최근 출현에 첫 번째 응답으로, 우리는 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 제 (NA)의 처음 두 균주의 유전자에 대한 게놈 서열을 운반하는 플라스미드를 취득했다. 우리는 신속하게 곤충 세포에서 재조합 HA와 NA의 생산 배큘로 바이러스 발현 벡터를 구축 할 수 있었다 이러한 플라스미드를 사용하여. 이 발현 시스템은 잘 실험실에 설립되어 지속적인 연구 프로젝트 1-8의 많은 중요한 입증되었습니다. 곤충 세포는 올바르게 접혀 사후 병진 복합 단백질을 수정할 수있다. 이러한 수정은 많은 바이러스 당 단백질에 중요한 N-결합 글리코 실화를 포함한다. 따라서, 그것은 배큘로 바이러스 시스템이 꽤 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 발현하는 확립되는 것은 놀라운 일이 아니다. 사실, HA 및 NA 결정 구조의 많은 곤충 세포 발현 된 단백질을 사용하여 9-11 해결되었다. 또 다른 장점강한 폴리 헤드린 프로모터로부터 바이러스 감염 구동 식의 결과 - 시스템 (50 개 이상의 서로 다른 HA 단백질과 우리의 경험을 바탕으로) HA / L 세포 배양의 최대 30 밀리그램의 신뢰성 높은 단백질 수율에 자리 잡고 있습니다.
HA 및 NA 단백질....
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프로토콜
1. 재조합 배큘로 바이러스의 생성
- 배큘로 바이러스 전송 - 플라스미드에 복제
- 복제 H7 HA 및 수정 pFastBac 전송 플라스미드에 N9 NA의 ectodomain (또는 다른 HA 또는 NA 유전자) (소개 참조). HA는 N-말단 헥사 도메인 및 hexahistidine 태그를 포함하는 C-말단 삼량 체화 도메인 및 hexahistidine 태그를 함유뿐만 아니라 NA 용 용 벡터는, (도 1) 1,10,11,22 설명되었으며로부터 요청 될 수있다 저자.
해설 : 삼량 도메인없이 표현 HA의 ectodomains 특히 줄기 도메인에서, 구조적 중화 항원의 손실로 이어지는, 잘못 접힌됩니다. 마찬가지로, NA의 효소 기능은 적절한 테트라에 의존합니다. - bacmids의 생성
배큘로 바이러스 표현식을 사용하여 따라 DH10Bac 박테리아에 HA 및 NA 유전자를 포함하는 배큘로 바이러스 전송 - 플라스미드를 변환제조업체의 지침에 따라 시스템. 분리 및 제조 업체의 지침 (그림 2)에 따라 Midiprep 키트를 사용하여 bacmids를 정화.
- 복제 H7 HA 및 수정 pFastBac 전송 플라스미드에 N9 NA의 ectodomain (또는 다른 HA 또는 NA 유전자) (소개 참조). HA는 N-말단 헥사 도메인 및 hexahistidine 태그를 포함하는 C-말단 삼량 체화 도메인 및 hexahistidine 태그를 함유뿐만 아니라 NA 용 용 벡터는, (도 1) 1,10,11,22 설명되었으며로부터 요청 될 수있다 저자.
- 단백질의 발현 재조합 ....
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결과
A/Shanghai/1/13 및 A/Anhui/1/13에서 HA 분자는 약 20 ㎎ / L 문화의 수율을 잘 표현했다. 두 균주의 NA 분자는 A/Shanghai/1/13 0.2 ㎎ / L의 문화에서 A/Anhui/1/13 0.7 ㎎ / L에 이르기까지 적당한 표현 수준을 보여 주었다. 네 개의 단백질 제제는 발현 수준에 의해 설명 될 수의 NA보다 높은 순도의 복지가와 (그림 8a 및 B) 불순물이없는 매우 작은이 있었다. A/Shanghai/1/13 HA 더욱 광범위 중화 스토킹 반응성 인간 단클론 CR9114 23 ELISA를 사용하여 분석 하였다. 이 단클론 항체는 줄기 도메인에 민감한 구조적 에피토프에 결합하고이 도메인의 정확한 접는 프로브로 여기에 사용됩니다. 항체는 HA가 참 (그림 8C) 제대로 접혀 있다는 확신을주는 바인딩을 잘 보여줍니다. 반대로 H7 마우스 폴리 클로 날 혈청은 ELISA 제 (H7.......
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토론
배큘로 바이러스 발현 시스템을 이용하여 곤충 세포에서 인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 단백질의 발현이 곧장 앞으로 일반적이지만, 고려해야 할 여러 가지 중요한 점이있다. 서론에서 지적한 것처럼 그것은 HA와 NA의 ectodomains이 각각 삼량 또는 테트라 도메인과의 융합으로 표현되는, 중요합니다. 이 도메인은 일반적 ectodomain 표현하면 존재하지 않는 횡단 도메인의 도움으로 분자의 정확한 폴딩을 보장합니다. 예를 들어, 삼량 도메인없이 HA의 ectodomain의 표현은 올리고머와 줄기 도메인에 중요한 중화 에피토프의 불안정으로 이어집니다. 또한, 단백질의 안정성이 감소하고 곤충 세포 및 바큘로 바이러스 프로테아제에 의한 열화가 발생된다. 삼량 또는 테트라 도메인의 선택은 덜 중요하다 이르기까지 그들 중 다수 류신 지퍼 도메인 22T4 파지 foldons에 (11)는 지금까지 테스트 한 모두가 만족스러운 결과를 보여 주었다. 그것은 multibasic.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
우리는 단일 클론 항체 CR9114 패트릭 C. 윌슨에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 원래 A/Anhui/1/13 플라스미드에 제니퍼 Debeauchamp 리처드 웨비 감사합니다. 이 작품에 대한 부분 지원은 알레르기에 대한 국립 연구소에 의해 제공되고 전염성 프로그램 프로젝트 부여 AI097092-01A1와 CEIRS (인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 센터 HHSN26620070010C) 질병 - 투자되었다. FK는 오스트리아 과학 기금 (FWF)에서 어윈 슈뢰딩거의 교제 (J 3232)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 재료명/장비 | 회사 | 카탈로그 번호 | 설명/설명 |
| Bac-to-Bac Baculovirus 발현 시스템 | Invitrogen | 10359-016 | 제조사 지침을 따르십시오 |
| TNM-FH 곤충 매체 | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II 시약 | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA | Agarose Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| 폴리프로필렌 컬럼 (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| 최대 효율 DH10Bac 박테리아 | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure 플라스미드 필터 Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | 용출 및 세척 완충액 |
| Sf9 세포 | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
참고문헌
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603(2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P.
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재인쇄 및 허가
