Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

Summary

Aqui nós descrevemos uma forma de expressar antígenos de superfície do vírus da influenza corretamente dobradas e funcionais decorrentes do novo vírus H7N9 chinês em células de insetos. A técnica pode ser adaptado para expressar ectodomínios de quaisquer proteínas de superfície virais ou celulares.

Abstract

O sistema de expressão de baculovírus é uma ferramenta poderosa para a expressão de proteínas recombinantes. Aqui vamos usá-lo para produzir versões dobradas corretamente e glicosiladas da vírus influenza A glicoproteínas da superfície – a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Como um exemplo, nós escolhemos as proteínas HA e NA expressas pelo novo vírus H7N9, que surgiu recentemente na China. No entanto, o protocolo pode ser facilmente adaptado para proteínas HA e NA expressas por qualquer outro vírus influenza A e estirpes de vírus B. Proteínas recombinantes HA (rHA) e NA (ARN) são reagentes importantes para ensaios imunológicos, tais como ELISPOT e ELISA, e também são largamente utilizados para a padronização da vacina, a descoberta de anticorpos, o isolamento e caracterização. Além disso, as moléculas de NA recombinante pode ser usada para o rastreio de inibidores de moléculas pequenas e que são úteis para a caracterização da actividade enzimática do NA, bem como a sua sensibilidade para os antivirais. Proteínas HA recombinantes também são being testado como vacinas experimentais em modelos animais, e de uma vacina baseada na HA recombinante foi recentemente licenciada pela FDA para utilização em seres humanos. O método que descrevemos aqui para produzir essas moléculas é direto e pode facilitar a pesquisa nos laboratórios da gripe, uma vez que permite a produção de grandes quantidades de proteínas rápidas e de baixo custo. Embora aqui se concentrar em glicoproteínas da superfície do vírus da gripe, este método também pode ser usado para produzir outras proteínas de superfície virais e celulares.

Introduction

Como uma primeira resposta ao recente surgimento do romance H7N9 estirpe do vírus da gripe na China, adquirimos plasmídeos que transportam as seqüências genômicas para a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) genes dos dois primeiros isolados. Usando estes plasmídeos fomos capazes de construir rapidamente os vectores de expressão de baculovírus recombinante para a produção de HA e NA em células de insetos. Este sistema de expressão é bem estabelecida em nosso laboratório e provou crucial para muitos dos nossos projectos de investigação em curso ^1-8. Células de insetos são capazes de dobrar corretamente e após a tradução modificar proteínas complexas. Essas modificações incluem a glicosilação N-ligada, o que é importante para muitas glicoproteínas virais. Como tal, não é surpreendente que o sistema de baculovirus é bem estabelecida para a expressão de antigénios de superfície de vírus da gripe. De facto, muitas das estruturas cristalinas de HA e de NA foram resolvidos utilizando células de insecto expressaram proteínas ^9-11. Outra vantagem dosistema encontra-se em seus rendimentos de alta proteína confiáveis ​​de até 30 mg de HA / L de cultura de células (com base na nossa experiência com mais de 50 proteínas diferentes de HA) – uma conseqüência da infecção pelo vírus da expressão expulsos do forte promotor da poliedrina.

A remoção do domínio transmembranar e endodomínio de proteínas HA e NA permite a expressão de versões secretável, solúveis das proteínas e, assim, facilita muito o processo de purificação. Além disso, estes ectodomínios hexahistidina são marcados e podem, portanto, ser purificado usando a cromatografia de afinidade usando Ni ^{2 +-resina.} Os domínios transmembranares de proteínas HA e NA contribuir para homotrímero e formação homotetrâmero, respectivamente. A fim de preservar estes oligomerizations, que adiciona um domínio de trimerização C-terminal para a HA-, e um domínio N-terminal de tetramerização à AN construções (Figura 1). Temos mostrado de forma conclusiva que um tal domínio de trimerização estabiliza funcional, conserved epítopos conformacionais na haste do domínio de HA ^1. O tetramerização correta do NA também pode contribuir para corrigir dobrável e função NA ^10. Seqüências e vetores de transferência de baculovírus abrigando trimerização ou tetramerização domínios podem ser solicitadas aos autores ou de outros laboratórios no ^{campo, 9,10,12.}

Um outro problema importante para a expressão de proteínas secretadas em células de insectos é a escolha da linha de células para a direita. Enquanto Spodoptera frugiperda derivadas de células Sf9 suporte à replicação de baculovírus muito bem e são geralmente utilizados para resgate e propagação de vírus, eles têm a capacidade de secretar grandes quantidades de proteína limitado. Trichoplusia ni derivado BTI-TN-5B1-4 células (vulgarmente conhecido como High Five) têm uma capacidade maior secreção e são a linha de células de escolha para a expressão neste protocolo ^13,14. Além disso, é útil para reduzir ou até mesmo eliminar soro fetal bovino (FBS) a partir de culturas de expressão. Nós, portanto, usar a mídia com reduzida (3%) conteúdo FBS para o cultivo das ações de trabalho do vírus, e realizar a expressão da proteína em meio livre de soro.

Proteínas HA e NA recombinantes que são usados ​​para muitas técnicas imunológicas. Talvez o mais comum é em ensaios de ELISA para medir a soroconversão após a vacinação em humanos ou animais ^4,6,7,15. HAs e AEs são também utilizados em ensaios ELISPOT de ambas as moléculas estimuladoras e reagentes de detecção de células secretoras de anticorpos ^16. A sua utilização como iscas moleculares permite classificar especificamente para plasmablasts ou outros tipos de células-B, que podem então ser utilizados para isolar os anticorpos monoclonais (terapêutico) (mAbs). Moléculas de HA e NA recombinantes que são posteriormente usados ​​para a caracterização destes mAbs ^8. Outros exemplos incluem o estudo da estabilidade do pH ou especificidade do receptor de expressou por diferentes isolados de vírus, ou quantitativamente avaliar enzimática NA específicaactividade ou resistência a inibidores. Por outro lado, recombinante, purificada de HA pode ser utilizada para padronizar o conteúdo de HA de vacinas inactivadas do vírus da gripe.

Importante, rHA (e até certo ponto NA) candidatos a vacinas estão sendo testadas em modelos animais e ensaios clínicos em humanos com um candidato a vacina que está sendo licenciada pelo FDA em 2013 ^2,17-19. A vantagem destes novos vacinas é de que, devido à natureza recombinante destas proteínas, o processo de trabalho intensivo de geração de vírus de crescimento elevadas reassortant poderia ser evitado. Talvez ainda mais relevante é o fato de que seu rendimento HA é alto e reproduzível de estirpe para estirpe. Além disso, uma vez que essas vacinas são produzidas em um sistema de livre-ovo, eles não contêm contaminantes de proteínas que são problemáticos para indivíduos com alergias ao ovo.

Aqui nós escolhemos para expressar as proteínas HA e NA de dois isolados do romance chinês do vírus da gripe H7N9, A / Anhui/1/13 e A/Shanghai/1/13 ^20,21. Estes são exemplos oportunos, mas o protocolo descrito pode ser usado para a expressão de qualquer vírus influenza A e B proteínas HA ou NA e pode ser adaptado para expressar quaisquer outras proteínas virais ou celulares segregados. Proteínas transmembranares triméricos ou tetraméricos pode ser clonado em cassetes de expressão utilizados para HA e NA, respectivamente. No entanto, as proteínas celulares secretados mais solúveis, como interferons, por exemplo, não precisa de um domínio adicional para a estabilização e pode ser expresso apenas com uma marca de hexa-histidina C-terminal.

Protocol

1. Geração de Baculovirus Recombinante A clonagem em baculovírus transferência plasmídeos Clone H7 HA e NA N9 ectodomínio (ou qualquer outro gene de HA ou NA), em plasmídeos de transferência pFastBac modificados (ver introdução). Vectores de HA contendo um domínio de trimerização C-terminal e uma etiqueta de hexa-histidina, assim como para NA contendo um domínio N-terminal de tetramerização e tag hexa-histidina, foram descritos 1,10,11,22 (Figura 1) e pode …

Representative Results

Moléculas de HA e de A/Shanghai/1/13 A/Anhui/1/13 expressa bem com rendimentos de cerca de 20 mg / L de cultura. Moléculas de NA de ambas as estirpes apresentaram níveis moderados de expressão variam entre 0,2 mg / L de cultura para A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L para A/Anhui/1/13. Todas as quatro preparações de proteína teve muito pouco ou nenhum impurezas (Figuras 8A e B) com vem sendo de pureza mais elevada do que o AN, que pode ser explicado por o nível de expressão. A/Shangh…

Discussion

Embora a expressão de proteínas do vírus da influenza, HA e NA em células de insecto utilizando o sistema de expressão de baculovírus é geralmente para a frente, existem diversos pontos importantes a considerar. É importante, como apontado na introdução, que ectodomínios da HA e NA são expressos em fusão com trimerização ou tetramerização domínios, respectivamente. Estes domínios de assegurar a correcta dobragem das moléculas normalmente assistida por o domínio transmembranar, o que não está prese…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bac-to-Bac Baculovirus expression system	Invitrogen	10359-016	Follow manufacturer's instructions
TNM-FH insect medium	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pen Strep	Gibco	15140-122
Polypropylene Columns (5 ml)	Qiagen	34964
Max efficiency DH10Bac bacteria	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit	Invitrogen	K210015
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-100G	for elution and wash buffers
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
High Five cells	Invitrogen	B85502