L'expression de l'hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l'aide du système d'expression baculovirus

Summary

Nous décrivons ici un moyen pour exprimer des antigènes de surface du virus de l'influenza correctement repliés et fonctionnels dérivés du nouveau virus H7N9 chinois dans des cellules d'insectes. La technique peut être adaptée pour exprimer ectodomaines de toutes les protéines virales ou cellulaires superficiels.

Abstract

Le système d'expression de baculovirus est un outil puissant pour l'expression de protéines recombinantes. Ici, nous l'utilisons pour produire des versions correctement repliées et glycosylés de la grippe A virus glycoprotéines de surface – l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). A titre d'exemple, nous avons choisi les protéines HA et NA exprimées par le nouveau virus H7N9 qui a récemment émergé en Chine. Cependant le protocole peut être facilement adapté pour HA et NA protéines exprimées par tout autre virus grippal A et les souches de virus B. Recombinant HA (RRS) et NA (ARN) des protéines sont des réactifs importants pour les dosages immunologiques tels que ELISPOT et ELISA, et sont également largement utilisés pour la normalisation des vaccins, découverte d'anticorps, l'isolement et la caractérisation. En outre, les molécules de NA recombinantes peuvent être utilisées pour cribler des inhibiteurs de petites molécules et sont utiles pour la caractérisation de la fonction enzymatique de la Na, ainsi que de sa sensibilité aux antiviraux. Protéines HA recombinées sont également being testés en tant que vaccins expérimentaux dans des modèles animaux, et un vaccin recombinant basé sur HA a récemment été autorisé par la FDA pour une utilisation chez l'homme. La méthode que nous décrivons ici la production de ces molécules est simple et peut faciliter la recherche dans les laboratoires de la grippe, car il permet la production de grandes quantités de protéines rapide et à faible coût. Bien que nous nous concentrons ici sur le virus de la grippe glycoprotéines de surface, cette méthode peut également être utilisé pour produire d'autres protéines virales et cellulaires de surface.

Introduction

Comme une première réponse à la récente émergence du roman H7N9 grippe souche du virus en Chine, nous avons acquis des plasmides portant les séquences génomiques de l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) des gènes des deux premiers isolats. L'utilisation de ces plasmides, nous avons pu construire rapidement des vecteurs d'expression de baculovirus recombinant pour la production de HA et NA dans des cellules d'insectes. Ce système d'expression est bien établi dans notre laboratoire et a prouvé crucial pour bon nombre de nos projets de recherche en cours ^1-8. Les cellules d'insectes sont capables de plier correctement et modifier des protéines complexes post-traductionnelle. Ces modifications comprennent la glycosylation N-liée, ce qui est important pour de nombreuses glycoprotéines virales. En tant que tel, il n'est pas surprenant que le système de baculovirus est bien établie pour les virus de la grippe exprimant les antigènes de surface. En fait, la plupart des structures cristallines HA et NA ont été résolus en utilisant cellulaires exprimé protéines d'insectes ^9-11. Un autre avantage de l'système réside dans ses fiables des rendements élevés de protéines allant jusqu'à 30 mg de culture de cellules HA / L (sur la base de notre expérience de plus de 50 protéines différentes HA) – une conséquence de virus infection expression entraînée par le promoteur de la polyhédrine forte.

L'élimination de l'endodomaine transmembranaire et des protéines HA et NA permet l'expression de versions solubles sécrétées, des protéines et donc facilite grandement le processus de purification. En outre, ces ectodomaines hexahistidine sont marqués et peuvent donc être purifiés en utilisant une Chromatographie d'affinité en utilisant ^{Ni2 +-résine.} Les domaines transmembranaires des protéines HA et NA, et contribuent à la formation de homotrimère homotétramère, respectivement. Afin de préserver ces oligomérisations, nous ajoutons un domaine de trimérisation C-terminale de la HA, et un tétramérisation domaine N-terminal de la NA constructions (Figure 1). Nous avons démontré de façon concluante que ce domaine de trimérisation stabilise fonctionnelle, conséquencesrved épitopes conformationnels sur la tige-domaine de HA ^1. Le tétramérisation correcte de la NA pourrait également contribuer à corriger le pliage et la fonction NA ^10. Séquences et des vecteurs baculovirus transfert hébergeant trimérisation ou tétramérisation domaines peuvent être demandés aux auteurs ou à d'autres laboratoires dans le ^{domaine, 9,10,12.}

Une autre question importante pour l'expression de protéines sécrétées dans des cellules d'insectes est le choix de la lignée cellulaire droite. Alors que Spodoptera frugiperda dérivé des cellules Sf9 en charge la réplication baculovirus très bien et sont généralement utilisés pour le sauvetage de virus et la propagation, ils ont la capacité de sécréter de grandes quantités de protéines limité. Trichoplusia ni dérivé BTI-TN-5B1-4 cellules (communément appelés High Five) avoir une capacité de sécrétion plus élevée et sont de la lignée cellulaire de choix pour l'expression dans ce protocole ^13,14. En outre, il est utile pour réduire ou même éliminer le sérum de veau fœtal (FBS) à partir de cultures d'expression. Nous utilisons donc médias réduite (3%) contenu FBS pour la croissance des stocks de roulement de virus, et nous effectuons l'expression de protéines dans des milieux sans sérum.

Protéines HA et NA recombinants sont utilisés pour de nombreuses techniques immunologiques. Peut-être la plus commune est dans des tests ELISA pour mesurer la conversion de sérum sur la vaccination chez les humains ou les animaux ^4,6,7,15. AN engage et sont également utilisées dans des analyses ELISPOT comme les deux molécules stimulatrices et des réactifs de détection pour les cellules sécrétant l'anticorps ^16. Leur utilisation comme amorces moléculaires permet de trier spécifiquement pour plasmoblastes ou d'autres types de cellules B qui peuvent ensuite être utilisés pour isoler des anticorps monoclonaux (thérapeutiques) (Acm). Des molécules de HA et NA recombinants sont ensuite utilisés dans la caractérisation de ces anticorps monoclonaux ^8. D'autres exemples comprennent l'étude de la stabilité du pH ou la spécificité du récepteur de a exprimé par différents isolats de virus, ou d'évaluer quantitativement enzymatique spécifique NAl'activité ou de la résistance aux inhibiteurs. En outre, recombinant, HA purifiée peut être utilisée pour normaliser teneur en HA de vaccins inactivés du virus de la grippe.

Surtout, AHr (et dans une certaine mesure NA) candidats vaccins sont actuellement testés dans des modèles animaux et des essais cliniques sur des humains avec un candidat vaccin est autorisé par la FDA en 2013 ^2,17-19. L'avantage de ces nouveaux vaccins est que, en raison de la nature de ces protéines recombinantes, le procédé de génération de virus réassortis de croissance élevés de main-d'œuvre pourrait être évité. Peut-être est d'autant plus pertinente que le fait de leur rendement de HA est élevée et reproductible d'une souche à l'. En outre, étant donné que ces vaccins sont produits dans un système sans oeuf, ils ne contiennent pas de contaminants protéiques qui sont problématiques pour des individus allergiques aux œufs.

Ici, nous avons choisi d'exprimer les protéines HA et NA de deux isolats du virus de la grippe roman H7N9 chinois, A / Anhui/1/13 et A/Shanghai/1/13 ^20,21. Ce sont des exemples rapides, mais le protocole décrit peuvent être utilisés pour l'expression selon l'une quelconque des protéines de la grippe A et B de HA ou de NA et peuvent être adaptés pour exprimer toutes les autres protéines virales ou cellulaires sécrétés. Protéines transmembranaires trimères ou tétramères peuvent être clonées dans les cassettes d'expression utilisées pour HA et NA, respectivement. Toutefois, les protéines cellulaires sécrétées plus solubles, comme les interférons, par exemple, n'ont pas besoin d'un domaine supplémentaire pour la stabilisation et peuvent être exprimés uniquement avec un tag hexa-histidine C-terminal.

Protocol

Une. Génération de baculovirus recombinant Clonage dans plasmides transfert baculovirus Clone H7 HA et NA N9 ectodomaine (ou tout autre gène HA ou NA) dans des plasmides de transfert pFastBac modifiés (voir introduction). Vecteurs pour HA contenant un domaine de trimérisation C-terminal et une étiquette hexahistidine, ainsi que pour NA contenant un domaine de tétramérisation N-terminal et tag hexa-histidine, ont été décrits 1,10,11,22 (Figure 1) et peuvent être…

Representative Results

Molécules HA de A/Shanghai/1/13 et A/Anhui/1/13 exprimé bien avec des rendements d'environ 20 mg / L de culture. NA molécules des deux souches ont montré des niveaux d'expression modérés allant de 0,2 mg / L de culture pour A/Shanghai/1/13 à 0,7 mg / L pour A/Anhui/1/13. Tous les quatre préparations de protéines ont très peu ou pas d'impuretés (figures 8A et B) Le fait d'être de pureté supérieur à AN qui peut s'expliquer par le niveau d'expression….

Discussion

Bien que l'expression de virus de la grippe HA et NA protéines dans des cellules d'insectes en utilisant le système d'expression baculovirus est généralement simple, il ya plusieurs points importants à considérer. Il est important, comme indiqué dans l'introduction, que les ectodomaines de HA et NA sont exprimés en fusion avec la trimérisation ou la tétramérisation des domaines, respectivement. Ces domaines d'assurer le repliement correct des molécules généralement assistée par le doma…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bac-to-Bac Baculovirus expression system	Invitrogen	10359-016	Follow manufacturer's instructions
TNM-FH insect medium	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pen Strep	Gibco	15140-122
Polypropylene Columns (5 ml)	Qiagen	34964
Max efficiency DH10Bac bacteria	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit	Invitrogen	K210015
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-100G	for elution and wash buffers
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
High Five cells	Invitrogen	B85502