バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現
Summary
ここでは、昆虫細胞中での新規な中国のH7N9ウイルス由来の正しく折り畳まれ、機能性インフルエンザウイルス表面抗原を発現する方法を記載している。技術は、任意のウイルスまたは細胞表面タンパク質の外部ドメインを発現するように適合させることができる。
Abstract
バキュロウイルス発現系は、組換えタンパク質の発現のための強力なツールです。ヘマグルチニン（HA）およびノイラミニダーゼ（NA） – ここでは、インフルエンザの正しく折り畳まれ、グリコシル化されたバージョンのウイルス表面糖タンパク質を産生するために使用すること。一例として、我々は最近、中国に出現した新規H7N9ウイルスにより発現HAおよびNA蛋白質を選びました。しかし、プロトコルが容易に任意の他のインフルエンザA及びBウイルス株によって発現されるHA及びNAタンパク質に適合させることができる。組換えHA（rHAの）とNA（RNA）タンパク質は、ELISPOTおよびELISAなどの免疫学的アッセイのための重要な試薬であり、ワクチンの標準化、抗体の検出、単離および特性のために広く使用されてもいる。さらに、組換えNA分子は、小分子阻害剤のスクリーニングに使用し、NAの酵素機能の特徴付け、ならびに抗ウイルス剤に対する感受性のために有用であることができる。組換えHAタンパク質はまた、バイあるNGは、動物モデルにおける実験ワクチンとしてテストされ、組換えHAに基づくワクチンは、最近、ヒトにおける使用のためのFDAによって認可されました。それは、迅速かつ低コストで大量のタンパク質の産生を可能にするため、我々はこれらの分子を産生するためにここで説明する方法は、単純であり、インフルエンザ実験室での研究を容易にすることができる。ここで我々は、インフルエンザウイルス表面糖タンパク質に焦点を当てているが、この方法はまた、他のウイルスおよび細胞表面タンパク質を産生するために使用することができる。
Introduction
中国における新規H7N9インフルエンザウイルス株の最近の出現に対する最初の応答として、赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）は、最初の2つの分離株の遺伝子についてのゲノム配列を有するプラスミドを買収した。我々はすぐに昆虫細胞における組換えHAおよびNAの生産のためのバキュロウイルス発現ベクターを構築することができたこれらのプラスミドを使用した。この発現系はよく我々の研究室で確立されていると私たちの現在進行中の研究プロジェクト1-8の多くに極めて重要であることが判明した。昆虫細胞は、正しくフォールディングおよび翻訳後のタンパク質複合体を改変することができる。これらの修飾は、多くのウイルス糖タンパク質のために重要であるN-結合型グリコシル化を含む。このように、バキュロウイルス系は、非常にインフルエンザウイルス表面抗原を発現するために確立されていることは驚くべきことではない。実際には、HAおよびNAの結晶構造の多くは、昆虫細胞発現タンパク質9-11を使用して解決されている。の別の利点強力なポリヘドリンプロモーターからのウイルス感染駆動発現の結果 – システムは、（50種類以上のHAタンパク質の経験に基づいて）、HA / Lの細胞培養の最大30ミリグラム、その信頼性の高いタンパク質収量にある。
HAおよびNAタンパク質の膜貫通及びエンドドメインの除去は、タンパク質の分泌、可溶性バージョンの発現を可能にし、大幅精製プロセスを容易にする。さらに、これらの外部ドメインは、ヘキサヒスチジンは、タグ付けされ、したがって、 の Ni 2 + -樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。 HAおよびNAタンパク質の膜貫通ドメインは、それぞれ、ホモ三量体およびホモ四量体の形成に寄与する。これらのオリゴマー化を維持するために、我々はNAにHA-およびN-末端四量体化ドメインへのC末端三量体化ドメインを追加する（ 図1）を構築する。私たちは、このような三量体化ドメインは、機能、conseを安定化することを決定的に示しているHAの1の茎ドメインに立体配座エピトープをrved。 NAの正しい四も折り畳みおよびNA機能10を修正するために貢献するかもしれない。三量化や四のドメインを保有する配列と、バキュロトランスファーベクターは、著者からまたはフィールド、9,10,12における他の研究室から要求することができます。
昆虫細胞における分泌タンパク質の発現のためのもう一つの重要な問題は、右の細胞株の選択である。 スポドプテラ·フルギペルダに由来しながら、Sf9細胞は非常によくバキュロウイルス複製を支持し、一般に、ウイルスレスキューおよび増殖のために使用され、それらは、大量のタンパク質を分泌する能力が限られている。 イラクサギンウワバが （一般にハイファイブとして知られている）BTI-TN-5B1-4細胞由来高い分泌能力を有し、このプロトコル13,14における発現のために選択される細胞株である。さらには、ウシ胎児血清を減らしたり、除去しておくと便利です（FB発現培養からのS）。そこで我々は、ウイルスワーキングストックを増殖させるために減少（10％）のFBS含有量のメディアを使用し、我々は、無血清培地におけるタンパク質発現を行う。
組換えHAおよびNAタンパク質は、多くの免疫学的技術のために使用される。おそらく、最も一般的なものは、ヒトまたは動物にワクチン接種時4,6,7,15血清変換を測定するためのELISAアッセイである。有したNAは、抗体分泌細胞を16刺激分子および検出試薬の両方としてELISPOTアッセイにおいて使用される。ベイト分子としてのそれらの使用は、具体的には、次いで（治療的）モノクローナル抗体（mAb）を単離するために使用することができる形質芽又はB-細胞の他のタイプのソートすることを可能にする。組換えHAおよびNA分子はさらに、これらのmAb 8の特徴付けに使用される。他の例では、pH安定性又は受容体特異性が異なるウイルス分離株によって発現有する研究、または定量的に特異的なNAの酵素を評価することが含まれる阻害剤に対する活動や抵抗。さらに、組換え、精製されたHAは、不活性化インフルエンザウイルスワクチンのHA含量を標準化するために使用することができる。
重要なのは、rHAの（そしてある程度NA）ワクチン候補は、現在、1ワクチン候補が2013 2,17-19にFDAによって認可されていると、動物モデルおよびヒト臨床試験で検証されています。これらの新規なワクチンの利点は、これらのタンパク質の組換え性質のために、高い成長再集合ウイルスの発生の労働集約的なプロセスを回避することができる、ということである。おそらく、より関連性の高い彼らのHA収率が高く、歪みの歪みに再現可能であるという事実である。これらのワクチンは、卵を含まない系で生産されるためにも、彼らは卵アレルギーを持つ人々のための問題となるタンパク質の汚染物質を含んでいない。
ここでは、新たな中国のH7N9インフルエンザウイルスは、A /アインの2分離株からのHAおよびNA蛋白質を発現することにしましたui/1/13とA/Shanghai/1/13 20,21。これらは、タイムリーな例であるが、記載されたプロトコルは、任意のインフルエンザA及びB HA又はNAタンパク質の発現のために使用することができ、任意の他の分泌されたウイルスまたは細胞性蛋白質を発現するように適合させることができる。三量体または四量体の膜貫通タンパク質は、それぞれ、HA及びNAために使用される発現カセットにクローニングすることができる。しかし、ほとんど可溶性分泌細胞タンパク質は、例えば、インターフェロンのように、安定化のための追加のドメインを必要としないし、C末端ヘキサヒスチジンタグと共にのみ表現することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
バキュロウイルス発現系を用いた昆虫細胞におけるインフルエンザウイルスHAおよびNAタンパク質の発現は、一般的に単純であるが、いくつかの考慮すべき重要な点がある。導入部で指摘したようにこれは、HAとNAの細胞外ドメインは、それぞれ、三量体化又は四量体化ドメインとの融合で発現されることが、重要である。これらのドメインは、通常、細胞外ドメインが発現されている場合存?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、モノクローナル抗体CR9114のためにパトリックC.ウィルソンに感謝したいと思います。我々はまた、元のA/Anhui/1/13のプラスミドについてジェニファーDebeauchampとリチャードウェビーに感謝します。この仕事のための部分的なサポートは、アレルギーのための国立感染症研究所が資金提供プログラムプロジェクト無償AI097092-01A1とCEIRS（インフルエンザ研究および監視のためのセンター·オブ·エクセレンス、HHSN26620070010C）によって提供された。 FKは、オーストリア科学基金（FWF）からアーウィンシュレーディンガーの交わり（J 3232）によってサポートされていました。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
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