Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem
Summary
Hier beschreiben wir einen Weg, korrekt gefaltete und funktionelle Influenza-Virus-Oberflächenantigene von den neuen chinesischen H7N9-Virus in Insektenzellen abgeleitet auszudrücken. Die Technik lässt sich an beliebigen Ektodomänen viraler oder zellulärer Oberflächenproteine exprimieren.
Abstract
Das Baculovirus-Expressionssystem ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Expression von rekombinanten Proteinen. Hier verwenden wir es richtig gefaltet und glykosylierten Varianten des Influenza-A-Virus-Oberflächen Glykoproteinen produzieren – das Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA). Als Beispiel haben wir die HA-und NA-Proteinen durch das neuartige H7N9-Virus, das vor kurzem in China entstanden ausgedrückt. Jedoch kann das Protokoll leicht für HA-und NA-Proteine von einem anderen Influenza A-und B-Virus-Stämmen exprimiert angepasst werden. Rekombinante HA (rHA) und NA (RNA)-Proteine sind wichtige Reagenzien für immunologische Tests wie ELISA und ELISPOT und sind auch im breiten Einsatz für die Impfstoff-Standardisierung, Antikörper-Entdeckung, Isolierung und Charakterisierung. Darüber hinaus können rekombinante NA-Moleküle Bild für kleine Moleküle als Inhibitoren verwendet werden und sind nützlich für die Charakterisierung der enzymatischen Funktion der NA, sowie seiner Empfindlichkeit gegenüber antiviralen Mitteln. Rekombinanten HA-Proteine sind auch being getestet experimentelle Vakzine in Tiermodellen, und ein Impfstoff auf Basis von rekombinanten HA wurde kürzlich von der FDA zur Verwendung bei Menschen zugelassen. Die Methode, die wir hier beschreiben, diese Moleküle zu erzeugen ist einfach und kann die Forschung in Labors Influenza zu erleichtern, da es für die Produktion von großen Mengen von Proteinen schnell und zu geringen Kosten. Obwohl hier konzentrieren wir uns auf Influenza-Virus Oberflächen-Glycoproteine, kann diese Methode auch verwendet werden, um andere virale und zelluläre Oberflächenproteine zu produzieren.
Introduction
Als eine erste Reaktion auf die jüngste Aufkommen der neuen H7N9 Influenzavirusstamm in China, haben wir Plasmide die genomischen Sequenzen für Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA)-Gene der ersten zwei Isolate. Unter Verwendung dieser Plasmide waren wir in der Lage, schnell zu konstruieren Baculovirus-Expressionsvektoren zur Produktion von rekombinanten HA-und NA in Insektenzellen. Dieses Expressionssystem ist in unserem Labor etabliert und ist entscheidend für viele unserer laufenden Forschungsprojekte 8.1 bewiesen. Insektenzellen sind in der Lage, korrekt zu falten und post-translational komplexe Proteine ändern. Diese Modifikationen umfassen N-verknüpften Glykosylierung, die für viele virale Glykoproteine ist. Als solches ist es nicht verwunderlich, dass das Baculovirus-System exprimiert wird ganz für Influenzavirus-Oberflächenantigen hergestellt. In der Tat sind viele der HA-und NA-Kristallstrukturen unter Verwendung von Insektenzellen exprimierte Proteine 9-11 gelöst. Ein weiterer Vorteil derSystems liegt in seiner zuverlässigen hohen Protein-Ausbeuten von bis zu 30 mg HA / L Zellkultur (basierend auf unserer Erfahrung mit mehr als 50 verschiedene HA-Proteine) – eine Folge von Virus-Infektion Ausdruck angetrieben von der starken Polyhedrinpromotor.
Entfernung der Transmembran-und Endodomäne der HA-und NA-Proteine können für die Expression von sezernierbaren lösliche Versionen der Proteine und somit das Reinigungsverfahren erheblich vereinfacht. Darüber hinaus sind diese Ektodomäne Hexahistidin markiert und kann daher unter Verwendung von Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni 2 +-Harz gereinigt werden. Die Transmembrandomänen von HA und NA-Proteine tragen zu Homotrimer Homotetramer und Bildung auf. Um diese Oligomerisierungen bewahren, eine C-terminale Trimerisierungsdomäne fügen wir die HA-und ein N-terminales Tetramerisierungsdomäne zum NA konstruiert (Abb. 1). Wir haben eindeutig gezeigt, dass eine solche Trimerisierungsdomäne stabilisiert funktional, Folgenrved Konformationsepitope auf dem Halm-Domäne von HA 1. Die richtige Tetramerisierungsdomäne des NA könnte auch Falt-und NA-Funktion 10 zu korrigieren beitragen. Sequenzen und Baculo-Transfer-Vektoren, Trimerisierung oder Tetramerisierung Domains können von den Autoren oder von anderen Laboratorien auf dem Gebiet, 9,10,12 angefordert werden.
Eine weitere wichtige Frage für die Expression von sezernierten Proteinen in Insektenzellen ist die Auswahl der richtigen Zelllinie. Während Spodoptera frugiperda Sf9-Zellen abgeleitet unterstützen Baculovirus-Replikation sehr gut und werden im Allgemeinen für die Virusausbreitung und Rettungs verwendet, sie haben Kapazität, große Mengen an Protein zu sezernieren beschränkt. Trichoplusia ni gewonnen BTI-TN-5B1-4-Zellen (allgemein bekannt als High Five) eine höhere Kapazität und Sekretion sind die Zelllinie der Wahl, die für die Expression in diesem Protokoll 13,14. Darüber hinaus ist es hilfreich, zu reduzieren oder sogar beseitigen fötalem Rinderserum (FBS) von Expressionskulturen. Wir verwenden daher mit Medien reduziert (3%) FBS Inhalt für das Wachstum der Viren-Arbeits Aktien, und wir haben die Proteinexpression in Serum-freien Medien durchzuführen.
Rekombinanten HA-und NA-Proteine für viele immunologische Techniken verwendet. Vielleicht die häufigste ist in ELISA-Tests zur Messung der Serumkonversion bei der Impfung von Menschen oder Tieren 4,6,7,15. Aufweist und NA sind auch in ELISPOT Assays sowohl stimulierende Moleküle und Nachweisreagenzien für Antikörper sekretierende Zellen 16 verwendet. Ihre Verwendung als molekulare Köder ermöglicht, die speziell für Plasmablasten oder andere Arten von B-Zellen, die dann verwendet werden kann, um (therapeutische) monoklonalen Antikörpern (mAbs) zu isolieren, zu sortieren. Rekombinanten HA-und NA-Moleküle werden in der Charakterisierung dieser mAbs 8 verwendet. Weitere Beispiele sind die pH-Stabilität zu studieren oder Rezeptorspezifität wurde von anderen Virus-Isolate ausgedrückt, oder quantitativ Beurteilung spezifischer NA enzymatischeAktivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren. Außerdem rekombinante, gereinigte HA HA verwendet werden, um Inhalte von inaktivierten Influenza-Virus-Impfstoffen zu standardisieren.
Wichtig ist, rHA (und zu einem gewissen Grad NA)-Impfstoff-Kandidaten werden derzeit in Tiermodellen und klinischen Studien am Menschen mit einem Impfstoff von der FDA im Jahr 2013 zugelassen 2,17-19 getestet. Der Vorteil dieser neuartigen Impfstoffen ist, dass aufgrund der Natur der rekombinanten Proteine, die arbeitsintensive Prozess der Erzeugung von hohen Wachstums reassortanten Viren vermieden werden. Vielleicht noch relevant ist die Tatsache, dass ihre Ausbeute an HA hohe und reproduzierbare von Stamm zu Stamm. Da diese Impfstoffe in einer Eierfreien System hergestellt, sie enthalten keine Proteinverunreinigungen, die problematisch für Menschen mit Allergien Ei sind.
Hier haben wir uns für die HA-und NA-Proteine aus zwei Isolate des neuen chinesischen H7N9 Influenza-Virus A / Anh ausdrückenui/1/13 und A/Shanghai/1/13 20,21. Das sind zeitnahe Beispiele, aber die beschriebene Protokoll kann zur Expression Influenza A-und B-HA-oder NA-Proteine verwendet werden, und kann angepasst werden, um irgendwelche anderen sekretierten virale oder zelluläre Proteine zu exprimieren. Trimeres oder tetrameres Transmembranproteine können in die Expressionskassetten für HA und NA verwendet kloniert sind. Allerdings sind die meisten löslichen sekretierten zelluläre Proteine, wie Interferone, zum Beispiel nicht einen zusätzlichen Domänen zur Stabilisierung brauchen, und kann nur mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag ausgedrückt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl die Expression von Influenzavirus HA-und NA-Proteinen in Insektenzellen unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystem ist in der Regel geradlinig, gibt es einige wichtige Punkte zu beachten. Es ist wichtig, wie in der Einleitung erwähnt, dass die Ektodomäne von HA und NA werden in Fusion mit Trimerisierung oder Tetramerisierung Domänen exprimiert sind. Diese Bereiche gewährleisten eine korrekte Faltung der Moleküle in der Regel von der Transmembran-Domäne, die nicht vorhanden ist, wenn nur die Ektodom?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Patrick C. Wilson für monoklonale Antikörper CR9114 danken. Wir danken auch Debeauchamp Jennifer und Richard Webby für die ursprünglichen A/Anhui/1/13 Plasmide. Teilweise Unterstützung für diese Arbeit wurde durch das Nationale Institut für Allergie-und Infektionskrankheiten vorgesehen finanzierte Programm Projektstipendium AI097092-01A1 und CEIRS (Centers of Excellence für Influenza-Forschung und Überwachung, HHSN26620070010C). FK wurde von einem Erwin-Schrödinger-Stipendium (J 3232) aus dem österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) unterstützt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
