מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

Summary

microrheology מעקב חלקיק יכול להיות בשימוש למי שאינו הרסני לכמת ומרחבית מפת שינויים בתכונות מכאניות מטריצה ​​תאית במודלי גידול 3D.

Abstract

Microenvironment המכני הוכח לפעול כרגולטור חיוני של גידול בצמיחת התנהגות ואיתות, אשר עצמו שופץ והותאם כחלק מסדרה של יחסי גומלין מורכבים, דו כיוונית mechanosensitive. בעוד שהפיתוח של מודלים 3D גידול ביולוגי רלוונטיים הקל מחקרים מכניסטית על ההשפעה של rheology מטריצה ​​על צמיחת גידול, הבעיה ההפוכה של שינויי מיפוי בסביבה מכאנית הנגרמת על ידי גידולים נותרת מאתגרת. כאן, אנו מתארים את יישום microrheology מעקב חלקיקים (PTM) בשילוב עם מודלים 3D של סרטן לבלב כחלק מגישה חזקה וברת קיימא עבור אורכי ניטור שינויים פיזיים בmicroenvironment הגידול, באתרם. המתודולוגיה שתוארה כאן משלבת מערכת של הכנה במבחנה המודלים 3D המשובץ במטריצה ​​תאית מודל פיגום (ECM) של סוג קולגן אני עם בדיקות שכותרתו fluorescently מפוזרות באופן אחיד לפוsition ומדידות microrheology תלוי זמן לאורך כל הדגימה. במבחנה גידולים הם מצופים ונחקרו בתנאים מקבילים באמצעות צלחות הדמיה multiwell. ציור על שיטות מבוססות, קטעי וידאו של תנועות חללית נותב הופכים באמצעות היחס כלליים סטוקס איינשטיין (GSER) לדווח מודולוס מורכב התדירות תלויה הגזירה viscoelastic, G (ω) *. מכיוון שגישה זו היא מבוסס הדמיה, אפיון מכאני ממופה גם הוא על שדות המרחבית מועבר אור גדולים לדווח בו זמנית שינויים איכותיים בגודל גידול 3D ופנוטיפ. נציג תוצאות מראים מנוגד תגובה מכאנית בתת אזורים הקשורים בשפלה מקומית-Induced פלישת מטריקס, כמו גם כיול מערכת, אימות נתונים מוצגים. תוצאות בלתי רצויות מטעויות ניסיוניות נפוצות ופתרון בעיות בנושאים אלה גם מוצגות. פורמט ציפוי תרבות 96 היטב 3D מיושם בפרוטוקול זה הוא גonducive למתאם של מדידות microrheology עם מבחני מיון טיפוליים או הדמיה מולקולרית כדי לקבל תובנות חדשות על השפעה של טיפולים או גירויים ביוכימיים בmicroenvironment המכני.

Introduction

זה ברור מגוף הולך וגדל של ראיות בספרות שתאי הסרטן, כמו בתאי האפיתל של יונקים שאינם ממאירים, הם רגישים מאוד לתכונות מכאניות וbiophysical של מטריקס סביב תאי (ECM) ורכיבי המיקרו אחרים ^1-9. מחקרים מכניסטית אלגנטיים סיפקו תובנות לתוך התפקיד של קשיחות תאית כשותף איתות mechanosensitive מורכב המווסת את ההתנהגות ממארת צמיחה והמורפוגנזה ^2,3,10,11. עבודה זו כבר בהנחייתם בפרט על ידי הפיתוח של 3D במודלי גידול מבחנה שלשחזר ביולוגי ארכיטקטורת רקמה רלוונטית וניתן לגדל בחומרי פיגום עם מכניקה מתכונן וצלמו ידי מיקרוסקופיה אופטית ^12-19. עם זאת, הצד השני של הדו שיח הזה בין mechanoregulatory גידול והמיקרו, שדרכו תאי הסרטן בתורו לשנות את rheology של סביבתם האחר, נותר במידה מסוימתקשה יותר ללמוד. לדוגמא, במהלך תהליכי פלישה, תאים בפריפריה של גידול עשויים לעבור אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) ולהגדיל את הביטוי של metalloproteases המטריצה ​​(MMPs) שגורמים להשפלה מקומית של ^20-22 ECM, אשר בתורו משפיע mechanosensitive צמיחת התנהגות של תאים סרטניים הפרוקסימלי אחרים. באמצעות מגוון רחב של תהליכים ביוכימיים, תאים סרטניים לחייג הרף הקשיחות המקומית של הסביבה שלהם למעלה ולמטה כדי להתאים את התהליכים שונים בזמנים שונים. המתודולוגיה שתוארה כאן היא מונעת על ידי הצורך בכלים אנליטיים הלדווח על שינויים מקומיים בנוקשות והציות של ECM בצמיחה, שיכול להיות משולב עם מודלים גידול 3D וקורלציה אורכים עם שינויים ביוכימיים ופנוטיפי ללא הפסקת התרבות.

בחיפוש טכניקה מתאימה ליישום בהקשר זה, microrheology חלקיקי המעקב (PTM) מתגלה כמועמד חזק.בשיטה זו, הייתה חלוצה במקור על ידי מייסון וייץ ^23,24, משתמש בתנועה של בדיקות מעקב מוטבעות בנוזל מורכב לדווח מודולוס התדירות תלויה מורכב הגזירה viscoelastic, G * (ω) בקני מידת אורך מיקרון. גישה כללית זו פותחה עם וריאציות מרובות מתאימות ליישומים שונים בעניין, קולואידים, ביופיסיקה-מרוכז רכה ופיסיקה פולימר ^25-31. יש PTM יתרונות מסוימים ביחס לשיטות אחרות, שכן מונה המציין viscoelasticity המקומי מסופק על ידי וידאו הדמיה שאינה הרסנית של בדיקות מעקב ביוכימית פעילה המשולבות בעת הכנת התרבות ולהישאר במקום לאורך תקופות ממושכות של צמיחה. זאת בניגוד למדידות תקן זהב עם rheometer oscillatory גזירה בתפזורת, שבהכרח דורש הפסקת התרבות ומדווח rheology מקרוסקופית התפזורת של המדגם ולא מדידות נקודה בתוך microenvir גידול 3D המורכבonment. ואכן מספר מחקרים הדגימו את התועלת של פרשנות מדידות של תנועות חללית נותב או סביב תאים סרטניים או שאינו סרטניים למדוד עיוותים הקשורים לתא הגירה ^32, לחץ מכאני הנגרם על ידי אליפטית הרחבת ^33, rheology תאיים ^34,35, ו למפה לחצים מכאניים וזנים ברקמות מהונדסות ^36, ויחס בין גודל הנקבובית ומהירות פלישת ^37. טכניקות אחרות מתאימות לmicrorheology, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ניתן ליישם, אבל בעיקר לחיטוט נקודות במדגם השטח וגם עלולות להוות בעיות עקרות התרבות שתסבכנה מדידות אורך ^38.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מקיף הכולל שיטות לצמיחה של הספרואידים גידול 3D מתאימים להעברה לECM עם בדיקות ניאון משובצות לשיטות וידאו חלקיקי מעקב וניתוח לאופן מהימן מיפוי מרחבישינויים בmicrorheology לאורך זמן בתרבות. ביישום הנוכחי, מודלים 3D גידול גדלים בפורמט multiwell עם נוף לכיוון שילוב של מדידות microrheology עם מבחני אחרים מסורתיים (למשל, cytotoxicity) שהפורמט הזה הוא תורם ל. באיור נציג זה של במבחנה הספרואידים זה אנו המתודולוגיה תרבות 3D באמצעות PANC-1 תאים, שורת תאי סרטן לבלב הוקמה הידועה כדי ליצור הספרואידים ^39, אבל כל המדידות שתוארו במסמך זה הן החלים רחב ללמוד בגידולים מוצקים תוך שימוש במגוון של שורות תאים מתאים לתרבות 3D. מכיוון שהוא מבוססת הדמיה בשיטה זו המיסוד הוא אידיאלי לשיתוף רישום של נתונים microrheology ברזולוציה גבוהה עם שדות מועברים האור גדולים של דעה כי לדווח על שינויים בצמיחת תאים, הגירה ופנוטיפ. יישום PTM משולב עם מיקרוסקופ אור להעביר בדרך זו מניחה מיצוב לשחזור של Wh הבמה מיקרוסקופich הוא בדרך כלל זמין במיקרוסקופים ביולוגיים epifluorescence widefield המסחרי ממונעים. הפרוטוקול שפותח בהמשך יכול להיות מיושם עם כל מיקרוסקופ ביולוגי הקרינה אוטומטית מצויד באופן סביר. זוהי שיטה עתירת נתונים מיסודו, שדורשת רכישה של ג'יגה בייט של נתונים במיקרוסקופ וידאו דיגיטליים לעיבוד מקוון.

בפרוטוקול הבא, פרוטוקול 1 נוגע להכנה הראשונית של הספרואידים גידול אשר מתואר כאן על ידי שימוש בכיסוי agarose אבל יכול להיות תחליף עם מגוון רחב של שיטות אחרות כגון ירידה תלויה ^40, או תרבות סיבובית ⁴¹ טכניקות. פרוטוקול 2 מתאר את התהליך של הטבעת הספרואידים בפיגום קולגן אם כי לחלופין, במבחנה גידולי 3D יכולים להיות גדלו באנקפסולציה או הטבעה של תאי resuspended בECM ^12,15, ולא הספרואידים אינם חסיד מראש יצרו אחת. הפרוטוקולים הבאים מתארים נהלים לobtaining מדידות microrheology זמן נפתר על ידי הרכישה ועיבוד של נתונים במיקרוסקופ וידאו, בהתאמה. עיבוד נתונים מתואר באמצעות MATLAB, מה שהופך את השימוש בגרות קוד פתוח לPTM הבנוי על אלגוריתמים שתוארו במקור על ידי קרוקר וגריר ^42, שיש גם פותחו בהרחבה לפלטפורמות תוכנה שונות (ראה http://www.physics.emory.edu/ ~ שבועות / IDL /).

Protocol

1. Spheroids גידול Culturing מערבבים 10 מיליליטר של מים כיתה תרבית תאים עם 0.1 גרם של agarose כדי להשיג פתרון agarose 1%. פתרון agarose חום לעיל 70 מעלות צלזיוס (בערך 14 שניות במיקרוגל רגיל או באמצעות צלחת חימום) לפני al…

Representative Results

כדי לוודא את תוקפו של G * מדידות (ω) בעמדות מקומיות בתוך microenvironment גידול מודל מורכב, שני ניסויי אימות ראשוניים בוצעו. ראשית, אנו ביקשנו לאמת את המדידות שלנו נגד "תקן הזהב" של rheometry הגזירה תנודתית בתפזורת. הכנו דגימות זהות של מטריצת הקולגן (ללא תאים) בריכוז ש?…

Discussion

בפרוטוקול זה אנו מציגים אסטרטגיה חזקה וישימה באופן נרחב לאורכי מעקב אחר שינויים מקומיים בקשיחות ECM במודלי גידול 3D. אנחנו מדמיינים שמתודולוגיה זו יכולה להיות מאומצת על ידי ביולוגים בסרטן וBiophysicists מתעניינים בהתנהגות mechanosensitive מעורבת בשיפוץ מטריקס במהלך גידול ותהליכי …

Materials

Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, California	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, California	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate  cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA