Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

Summary

Microrheology-particella di monitoraggio può essere utilizzato per non distruttivo quantificare e spazialmente mappare i cambiamenti nella matrice extracellulare proprietà meccaniche in modelli tumorali 3D.

Abstract

Il microambiente meccanico ha dimostrato di agire come un regolatore cruciale del comportamento di crescita tumorale e di segnalazione, che è a sua rinnovato e modificato come parte di una serie di complesse interazioni bidirezionale mechanosensitive. Mentre lo sviluppo di biologicamente rilevanti modelli tumorali 3D hanno facilitato studi meccanicistici sull'impatto della reologia matrice sulla crescita del tumore, il problema inverso dei cambiamenti di mappatura dell'ambiente meccanica indotta da tumori rimane difficile. Qui, descriviamo l'attuazione di particella inseguimento microrheology (PTM) in combinazione con i modelli 3D di cancro pancreatico come parte di un approccio efficaci e validi per monitorare longitudinalmente cambiamenti fisici nel microambiente tumorale, in situ. La metodologia qui descritta integra un sistema di preparazione di modelli in vitro 3D incorporato in un modello di matrice extracellulare (ECM) scaffold di collagene di tipo I con sonde fluorescente distribuiti uniformemente per Po-zione e tempo-dipendenti misurazioni microrheology in tutto il campione. tumori in vitro sono placcati e sondate in condizioni parallele utilizzando lastrine pozzetti. Basandosi su metodi stabiliti, i video dei movimenti della sonda traccianti vengono trasformati tramite il Relation Generalized Stokes Einstein (GSER) per segnalare il complesso dipendente dalla frequenza viscoelastica modulo di taglio, G * (ω). Poiché questo approccio è l'imaging-based, caratterizzazione meccanica è anche mappato su grandi campi spazio-luce trasmessa per segnalare contemporaneamente i cambiamenti qualitativi in ​​termini di dimensioni e fenotipo tumorale 3D. Risultati rappresentativi mostrano contrastanti risposta meccanica in sottoregioni associati localizzata degradazione della matrice invasione indotta e calibrazione del sistema, dati di convalida sono presentati. Esiti indesiderati da errori sperimentali comuni e la risoluzione dei problemi di questi problemi sono anche presentati. Il formato da 96 pozzetti placcatura cultura 3D realizzato in questo protocollo è conducive alla correlazione delle misure microrheology con test di screening terapeutici o imaging molecolare per acquisire nuove intuizioni impatto dei trattamenti o stimoli biochimici sul microambiente meccanico.

Introduction

E 'chiaro da una crescente evidenza nella letteratura che le cellule tumorali, come con le cellule epiteliali di mammifero non maligne, sono molto sensibili alle proprietà meccaniche e biofisiche della matrice extracellulare circostante (ECM) e altri componenti del microambiente ^1-9. Studi meccanicistici eleganti hanno fornito informazioni sul ruolo di rigidità extracellulare come partner segnalazione meccanosensibili complesso che regola il comportamento crescita maligna e la morfogenesi ^2,3,10,11. Questo lavoro è stato facilitato in particolare dallo sviluppo del 3D in modelli tumorali in vitro che ripristinano biologicamente architettura dei tessuti rilevante e possono essere coltivate in materiali impalcatura con la meccanica accordabili e ripreso da microscopia ottica ^12-19. Tuttavia, l'altro lato di questa finestra mechanoregulatory tra tumore e microambiente, attraverso il quale le cellule tumorali a sua volta modificare la reologia del loro ambiente, rimane alquantopiù difficile da studiare. Ad esempio, durante i processi di invasione, cellule alla periferia di un tumore possono subire la transizione epitelio mesenchimale (EMT) e aumentare l'espressione delle metalloproteasi della matrice (MMPs) che causano degradazione locale di ECM ^20-22, che a sua volta influenza il comportamento di crescita di meccanosensibili altre cellule tumorali prossimali. Attraverso una serie di processi biochimici, cellule tumorali continuamente comporre la rigidità locale del loro ambiente su e giù secondo processi differenti in momenti diversi. La metodologia qui descritta è motivata dalla necessità di strumenti analitici che segnalano variazioni locali nella rigidità e la conformità della ECM durante la crescita, che possono essere integrati con i modelli tumorali in 3D e correlati longitudinalmente con i cambiamenti biochimici e fenotipiche senza terminare la cultura.

Alla ricerca di una tecnica appropriata per l'attuazione in questo contesto, microrheology particella-tracking (PTM) emerge come un candidato forte.Questo metodo, sperimentato originariamente da Mason e Weitz ^23,24, utilizza il movimento delle sonde traccianti incorporati in un fluido complesso per segnalare il modulo complesso dipendente dalla frequenza viscoelastico taglio, G * (ω) su scale micron. Questo approccio generale è stato sviluppato con diverse variazioni adatti per diverse applicazioni in morbidi Materia Condensata, colloidi, biofisica e fisica dei polimeri ^25-31. PTM presenta alcuni vantaggi rispetto ad altri metodi, poiché letture di viscoelasticità locale sono ottenute dalla non distruttiva immagini video di sonde traccianti biochimicamente inattivi che sono incorporati al momento della preparazione cultura e rimangono sul posto per periodi prolungati di crescita. Questo è in contrasto con misure standard oro con un taglio oscillante rinfusa reometro, che richiede necessariamente la cessazione della cultura e riporta la reologia macroscopico massa del campione piuttosto che misurazioni di punti all'interno del complesso microenvir tumore 3Dbiente. Infatti numerosi studi hanno dimostrato l'utilità di interpretazione delle misure di movimenti sonda tracciante ao vicino cellule tumorali o non tumorali per misurare deformazioni associati migrazione cellulare ^32, stress meccanico indotto da uno sferoide espansione ^33, reologia intracellulare ^34,35, e per mappare sollecitazioni meccaniche nei tessuti ingegnerizzati ^36, e della relazione tra dimensione dei pori e la velocità dell'invasione ^37. Altre tecniche adatte per microrheology, quali microscopia a forza atomica (AFM) possono essere realizzate, ma soprattutto per sondare punti alla superficie del campione, oppure possono rappresentare coltura problemi di sterilità che complicano misurazioni longitudinali ^38.

Qui, descriviamo un protocollo completo che comprende metodi per la crescita di sferoidi tumorali 3D adatti per il trasferimento in ECM con sonde fluorescenti embedded per il video di particelle di tracciamento e di analisi per la mappatura attendibile spazialecambiamenti nella microrheology nel tempo nella cultura. Nel presente di attuazione, modelli tumorali 3D sono coltivate in formato più pozzetti con vista verso l'incorporazione di misure microrheology con altri metodi tradizionali (ad esempio, citotossicità), che questo formato è favorevole al. In questa illustrazione rappresentativo di questa metodologia che coltura in vitro sferoidi 3D in Uso PANC-1 le cellule, una linea cellulare di cancro del pancreas stabilito noto per formare sferoidi ^39, ma tutte le misurazioni qui descritti sono largamente applicabile per studiare di tumori solidi utilizzando una varietà di linee cellulari adatto per la cultura 3D. Poiché si basa Imaging-questo metodo intrinsecamente è ideale per la co-registrazione dei dati microrheology ad alta risoluzione con grandi campi a luce trasmessa di vista che segnalano cambiamenti nella crescita delle cellule, la migrazione e fenotipo. L'attuazione del PTM integrato con microscopia ottica trasmessa in questo modo assume un posizionamento riproducibile dei wh palco microscopioich è in genere disponibile sul motorizzati commerciale epifluorescenza widefield microscopi biologici. Il protocollo messo a punto sotto può essere realizzata con qualsiasi fluorescenza automatizzato microscopio biologico ragionevolmente attrezzata. Questo è un metodo ad alta intensità di dati intrinsecamente, che richiede l'acquisizione di gigabyte di dati microscopia video digitale per l'elaborazione offline.

Nella seguente protocollo, protocollo 1 riguarda la preparazione iniziale di sferoidi tumorali che viene descritto qui utilizzando overlay su agarosio ma potrebbero essere sostituiti con una varietà di altri metodi come appendere goccia ^40, o coltura rotante ⁴¹ tecniche. Protocollo 2 descrive il processo di inserimento sferoidi in un'impalcatura di collagene però in alternativa, in vitro tumori 3D in potessero essere coltivate da incapsulamento o incorporamento di cellule risospese in ECM ^12,15, piuttosto che singoli sferoidi non aderenti pre-formate. Protocolli successivi descrivono le procedure per OOME OTTENERE misurazioni microrheology risolta in tempo per l'acquisizione e l'elaborazione dei dati di microscopia video, rispettivamente. Il trattamento dei dati è descritta utilizzando MATLAB, facendo uso di routine open source per PTM costruita su algoritmi originariamente descritti da Crocker e Grier ^42, che sono anche stati ampiamente sviluppati per piattaforme software differenti (vedi http://www.physics.emory.edu/ ~ settimane / idl /).

Protocol

1. Spheroids Culturing tumorali Miscelare 10 ml di acqua di grado coltura cellulare con 0,1 g di agarosio per ottenere una soluzione di agarosio all'1%. Soluzione di agarosio calore sopra 70 ° C (circa 14 secondi in un forno a microonde standard o mediante una piastra riscaldante) prima aliquotando 40 ml di soluzione di agarosio in un pozzo su una piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C per almeno 1 ora mentre la raccolta delle cellule usando tecniche standard. …

Representative Results

Per verificare la validità di G * (ω) misurazioni in posizioni localizzate all'interno di un complesso microambiente modello di tumore, sono stati condotti due esperimenti di validazione iniziali. In primo luogo, abbiamo cercato di validare le nostre misure contro il "gold standard" della massa oscillante taglio reometria. Abbiamo preparato campioni identici di matrice di collagene (senza cellule) ad una concentrazione di 1,0 mg / ml di collagene. Questi campioni sono stati sondati con un reomet…

Discussion

In questo protocollo si introduce una strategia robusta e ampiamente applicabile per longitudinalmente rilevamento delle modifiche locali in ECM rigidità nei modelli tumorali 3D. Prevediamo che questa metodologia possa essere adottato da biologi cancro e biofisici interessati nel comportamento meccanosensibili implicati nel rimodellamento della matrice durante la crescita del tumore e dei processi di invasione. Quantificazione precisa di matrice cinetica di degradazione possa essere particolarmente utile a coloro che s…

Materials

Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, California	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, California	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate  cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA