Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen
Summary
Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.
Abstract
Testen das Schicksal der embryonalen oder pluripotenten Stammzellen-Derivate in in-vitro-Protokolle hat zu kontroversen Ergebnissen, die nicht ihre in vivo Potential nicht unbedingt geführt. Vorzugsweise sollten diese Zellen in einer geeigneten Umgebung embryonalen um ihre definitive Phänotyp erwerben platziert werden. Zudem hat Zelllinie Tracing Studien in der Maus nach der Markierung von Zellen mit Farbstoffen oder retroviralen Vektoren meist auf frühzeitig Maus-Embryonen mit noch schwach entwickelten Organe geblieben. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir Standard-und Ultraschall-vermittelten Mikroinjektion Protokolle verschiedener Mittel in den Zielregionen des Herzens in Maus-Embryonen an E9.5 und späteren Entwicklungsstadien zu injizieren. Embryonale Explantat oder Embryonen werden dann kultiviert oder links, um in utero weiter zu entwickeln. Diese Mittel umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, Virus, shRNA oder Stammzellen abgeleiteten Vorläuferzellen. Unsere Ansätze ermöglichen die Erhaltung der funktion der Orgel während der Überwachung der Migration und das Schicksal von markierten und / oder injizierten Zellen. Diese Technologien können auf andere Organe ausgedehnt werden und wird sehr hilfreich sein, wichtige biologische Fragestellungen in der Biologie der Entwicklung zu befassen.
Introduction
Vor mehr als einem Jahrzehnt haben menschliche embryonale Stammzellen (HuESCs) aus menschlichen Blastozysten 1 abgeleitet. Seitdem haben sich diese Zellen zum Gegenstand einer wichtigen Forschungsgebiet, das unerfüllte Fragen in der menschlichen Entwicklungsbiologie befasst. HuESCs haben ferner vorgesehen Hoffnungen in der regenerativen Medizin. In den letzten Jahren wurden menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) aus patientenspezifische Körperzellen erzeugt worden ist, die Bereitstellung von Modellen Erbkrankheit 2. Viele Protokolle für die In-vitro-Differenzierung von embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen zu verschiedenen Zelllinien, einschließlich Herz-Abstammungslinien 3, wurden berichtet. Die differenzierten Zellen werden oft durch Analyse von RNA und Protein-Expression, Immunfärbung und / oder in-vitro-Funktionstests phänotypisiert. Allerdings haben pluripotente Stammzelle Derivate in einem richtigen embryonalen Umgebung, um zu testen, ob sie die cel vollständig erwerben platziert werdenl Schicksal ihrer embryonalen Gegenstück, und ob sie den echten in vivo Funktion als Reaktion auf regionale Hinweise zu rekapitulieren. Während Tissue Engineering ist vielversprechend, ist es noch nicht bieten alle bekannten und unbekannten Signale der richtigen In-vivo-Entwicklung embryonalem Gewebe 4,5.
Markierung von Zellen mit Farbstoffen oder retroviralen Vektoren in Embryos, einschließlich Maus-Embryonen wurden wichtige Informationen über die Herkunft der embryonalen Zelllinien während der Herzentwicklung 6 gebracht. Beispielsweise Farbstoffinjektion in die Perikardhöhle von Maus-Embryonen ex vivo, gefolgt von in vitro-Kultur von isolierten Herzen, wurde zur epikardialen Zellen und deren Nachkommen 7 beschriftet. Allerdings Farbstoff und retroviralen Zell Kennzeichnung wurden meist auf frühe Mausembryonen mit noch schwach entwickelten Organen oder Hühnerembryonen, die leichter zugänglich sind 8 angewendet. Eine Ausnahme ist das Gehirn, die einfacher in E zum Ziel istmbryos 9,10. Ein solcher Ansatz ist noch nicht zu der embryonalen Mäuseherzen schlagen angewendet.
Um mit Farbstoffen oder Virus ergänzen direkte Markierung und Linienverfolgung in weiter fortgeschrittenen Stadium Maus-Embryonen und erwachsenen Mäusen durchzuführen, hat sich die Zellmarkierung Ansatz mit der Analyse von transgenen Mäusen mit Hilfe des Cre / lox-Technologie kombiniert. Das Cre / Lox-Ansatz jedoch 11 verfügt über einige Einschränkungen aufgrund der räumlich-zeitlichen Spezifität der genomischen regulatorischen Regionen verwendet, um die Expression der Rekombinase zu fahren, und die Effizienz des Cre / Lox Rekombination 12. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht vollständig die spezifischen Fragen der Zellmigration gesteuert erfasst Zellschicksal ehen, da es nur eine Vorstufe zu kennzeichnen nach der Aktivierung der regulatorischen Region zur Cre-Expression zu fahren. Es kann auch nicht an menschlichen Embryonen zu offensichtlichen ethischen Probleme gelten.
Angesichts dieser Einschränkungen, haben wir eine Reihe von neuen protocols, um eine Vielzahl von Zellmarkierungsmittel, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Viren, Modulatoren der Genexpression wie shRNA und DNA-basierte Zellmarkierung Vektoren oder Zellen der Maus Embryo E9.5 und späteren Stadien der Entwicklung in den Zielregionen der injizieren Herz.
Die DNA / Zellinjektionen mit einem Stereomikroskop und eine einfache Mikroinjektionsvorrichtung kombiniert mit ex vivo Embryokultur bis zu 48 h, oder isolierte Herz-oder embryonale Explantatkultur für 48-72 Std. Wir haben auch ein Ultraschall-vermittelte Mikroinjektion Protokoll in embryonalen Maus-Herzen in utero zu melden. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Entwicklung von Embryonen 13 und ermöglicht Langzeit-Follow-up der Injektate und / oder markierten Zellen.
Wir fanden, dass diese Ansätze die Erhaltung der Funktion des Organs und liefern eine repräsentative Umgebung als in-vitro-Tests der Stammzellpotential. Es bietet auch die Möglichkeit, Migration folgenvon markierten und / oder injizierten Zellen, ihr Schicksal zu überwachen. Letztendlich sollten diese ein besseres Verständnis der regionalen Gewebemusterbildung und biologische Schlüsselprozesse ergeben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die oben beschriebenen intrakardialen Injektion ex vivo-Protokolle sind für die myokardiale Funktion für mindestens 48 h im mittleren Stadium (E9.5-E11.5) Maus-Embryonen erhalten. Diese Injektions Ansätze ermöglichen räumlich gezielte Injektion von DNA oder Zellen. Die wenigen Beispiele in den Figuren 1-3 gezeigt nachweisen Konzept für die Abgrenzung ex vivo und in vivo molekularen Mechanismen der Entwicklungsprozesse, die in eingeschränkter Herz Regionen, wie EMT der e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Stiftung Leducq (Mitralklappe) und die Agence Nationale pour la Recherche (ANR gewähren Specistem) für die Finanzierung dieser Forschung.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| 기타 | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
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