Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon
Summary
Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.
Abstract
In vitro protokol embriyonik veya pluripotent kök hücre-türevlerinin kaderini test edilmesi zorunlu olarak in vivo potansiyel yansıtmaz tartışmalı sonuçlara yol açmıştır. Tercihen, bu hücreler, belirli bir fenotip elde etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmelidir. Ayrıca, boya veya retroviral vektörler ile hücrelerin etiketlenmesi sonra fare çalışmaları izleme hücre soyu hala az gelişmiş organları ile erken evre fare embriyoları çoğunlukla sınırlı kalmıştır. Bu sınırlamaları aşmak için, E9.5 ve gelişiminin sonraki aşamalarında fare embriyosunda kalp hedeflenen bölgelerde çeşitli maddeler enjekte etmek, standart ve ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokolleri tasarlanmıştır. Embriyonik eksplant ya da embriyolar ya da daha fazla kültürlendi utero geliştirmeye bırakılır. Bu maddeler, fluoresan boyalar, virüs, shRNAs veya hücre-türevi projenitör hücrelerini içerir. Bizim yaklaşımlar fu korunması için izinorganın nction göçünü ve işaretlenmiş ve / veya enjekte edilen hücrelerin kaderini gözlenerek. Bu teknolojiler diğer organlara uzatılabilir ve gelişim biyolojisinde önemli biyolojik soruları için çok yararlı olacaktır.
Introduction
Daha on yıl önce, insan embriyonik kök hücreleri (HuESCs) insan blastosistlerin 1 elde edilmiştir. O zamandan beri, bu hücreler, insan gelişim biyolojisi karşılanmamış sorular adresleri önemli bir araştırma alanının konusu haline gelmiştir. HuESCs ayrıca rejeneratif tıpta umut sağladı. Son yıllarda, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) 2 genetik hastalık modelleri sağlayan, hastaya özgü somatik hücrelerinden elde edilmiştir. Kalp soy 3 de dahil olmak üzere çeşitli hücre soyları, doğru ya da embriyonik uyarılmış pluripotent kök hücrelerin farklılaşması için in vitro protokol birçok rapor edilmiştir. Farklılaşmış hücreleri genellikle RNA ve protein ifadesi, immun boyama, ve / veya in vitro fonksiyonel testler analizi ile fenotiplenir. Bununla birlikte, pluripotent kök hücresi türevleri tam cel elde olup olmadığını test etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmesi gerekirl kendi embriyonik meslektaşı kaderi ve bölgesel uyaranlara yanıt olarak gerçek in vivo fonksiyonu özetlemek ister. Doku mühendisliği umut verici olmasına rağmen, henüz gelişmekte olan embriyonik doku 4,5 in vivo olarak uygun tüm bilinen ve bilinmeyen ipuçları sağlamaz.
Fare embriyoları içeren embriyolar, boyalar veya retroviral vektörlerle hücre etiketleme, kalp gelişimi 6 sırasında hücre soylarının embriyonik kökeni gibi önemli bilgileri getirdi. Örneğin, izole edilmiş kalpler in vitro kültürü ile, ardından ex vivo fare embriyoları, en perikardiyal boşluğu içine enjeksiyon boya, epikardiyal hücreleri ve bunların soyundan 7 etiketlemek için kullanıldı. Ancak, boya ve retroviral hücre etiketleme çoğunlukla 8 daha kolay erişilebilir hala az gelişmiş organ veya tavuk embriyolar, erken fare embriyoları tatbik edilmiştir. Bir istisna e hedef kolaydır, beyin tarafındanmbryos 9,10. Böyle bir yaklaşım, henüz dayak embriyonik fare kalp tatbik edilmemiştir.
Boyalar ya da virüs doğrudan etiketleme tamamlayıcı olarak ve daha ileri evre fare embriyo ve yetişkin farelerde izleme soy gerçekleştirmek için, hücre etiketleme yaklaşımı Cre / Lox teknolojisi kullanılarak transgenik farelerin analizi ile kombine edilmiştir. Cre / Lox yaklaşımı 11 ancak rekombinazın ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılabilir genomik düzenleyici bölgelerin uzaysal özgüllük ve Cre / Lox rekombinasyon 12 verim nedeniyle bazı sınırlamalar vardır. Sadece Cre ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılan düzenleyici bölgesi aktivasyonunun ardından bir ön etiket gibi Bundan başka, bu yaklaşım, tam hücre kaderin hücre göçü odaklı edinim özel soruları gidermez. Ayrıca bariz etik sorunları için insan embriyosu için geçerli olamaz.
Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, biz yeni p bir dizi tasarlanmışhedeflenmiş bölgelerinde bu gibi floresan boyalar, virüs, ve bu shRNAs DNA-bazlı hücre etiketleme vektörleri gibi gen ekspresyonu modülatörlerinin veya E9.5 ve gelişiminin sonraki evrelerinde de fare embriyo hücreleri gibi hücre etiketleme çeşitli ajanlar enjekte rotocols kalp.
DNA / hücre enjeksiyonları Stereomikroskopta ve 48 saat veya 48-72 saat boyunca izole kalp ya da embriyonik eksplant kültürü kadar ex vivo embriyo kültürü ile birlikte basit bir mikroenjeksiyon cihazı kullanın. Biz de rahimde fare embriyonik gönlünde bir ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokol rapor. Bu teknik embriyoların 13 gelişimini izleme sağlar ve injectates ve / veya etiketli hücrelerin uzun süreli takip için izin verir.
Biz, bu yaklaşımlar organın işlevini korumak ve kök hücre potansiyeli in vitro test daha temsili bir ortam temin ettiği bulunmuştur. Ayrıca göç takip fırsat sağlarkendi kaderini izlemek hücreleri etiketli ve / veya enjekte. Sonuç olarak, bu bölge, doku desenleme ve önemli biyolojik süreçlerin daha iyi bir anlayış elde edilmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda tarif edilen intra kardiyak ex vivo enjeksiyon protokolleri orta aşama (E9.5-E11.5) fare embriyo en az 48 saat boyunca miyokard fonksiyonu korumak için tasarlanmıştır. Bu enjeksiyon yaklaşımlar DNA ya da hücre konumsal hedeflenen enjeksiyon için izin verir. Şekiller 1-3 de gösterilen birkaç örnek ex vivo ve bu endokardiyal veya epikardiyal hücre EMT olarak kısıtlı kalp bölgelerinde yer alan gelişimsel süreçlerinin vivo moleküler mekanizmalar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Vakfı Leducq (Mitral) ve Agence Nationale bu araştırmalara fon la Recherche (ANR Specistem hibe) dökün kabul.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| 기타 | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
