배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출
Summary
우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.
Abstract
체외 프로토콜 배아 또는 다 능성 줄기 세포 – 파생 상품의 운명을 테스트하는 것은 반드시 자신의 생체 내 가능성을 반영하지 않습니다 논쟁의 결과로되었다. 바람직하게는, 이러한 세포는 확정적 표현형을 획득하기 위해 적절한 배아 환경에 배치되어야한다. 또한, 염료 또는 레트로 바이러스 벡터에 세포를 라벨링 한 후 마우스의 연구를 추적 세포의 혈통은 여전히 저조한 개발 기관과 함께 초기 단계의 마우스 배아에 주로 제한 남아있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 심장의 대상 지역에서 다양한 제를 주입하는 표준 및 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을 설계. 배아의 체외 이식편 또는 배아는 다음 배양 또는 추가 자궁 내에 개발하기 위해 왼쪽으로 수 있습니다. 이러한 에이전트는 형광 염료, 바이러스, shRNAs, 또는 세포 유래 전구 세포를 줄기 있습니다. 우리의 접근 방식은 쿵푸의 보존을 허용기관의 nction 마이그레이션 및 표시 및 / 또는 주입 된 세포의 운명을 모니터링하면서. 이러한 기술은 다른 장기로 확장 할 수 있으며, 개발 생물학의 주요 생물학적 문제를 해결하는 것은 매우 도움이 될 것입니다.
Introduction
이상 10 년 전 인간 배아 줄기 세포 (HuESCs)는 인간 배반포 1에서 파생되었다. 그 후,이 세포는 인간의 발달 생물학의 충족 문제를 해결 연구의 중요한 분야의 대상이되고있다. HuESCs는 또한 재생 의료에의 희망을 제공하고 있습니다. 최근 몇 년 동안, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)은 유전 질환 2의 모델을 제공하고, 환자 맞춤형 체세포에서 생성 된. 심장 계통 3를 포함한 다양한 세포 계통,으로 배아 또는 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대한 시험 관내 프로토콜에 많은 사람들이보고되고있다. 분화 된 세포는 종종 RNA 및 단백질 발현, 면역 염색, 및 / 또는 기능 시험 관내에서의 분석에 의하여 phenotyped된다. 그러나, 다 능성 줄기 세포 유도체들은 완전히 CEL 취득 여부를 테스트하기 위해 적절한 배아 환경에 배치 될 필요L의 자신의 배아 대응의 운명과 그들이 지역 신호에 대한 응답으로 정품 생체 기능을 요점을 되풀이할지 여부. 조직 공학이 유망하지만, 아직 미발달 티슈 4,5 개발되어 생체 내에서 적절한 모든 알려진 알려지지 단서를 제공하지 않는다.
마우스 배아 등의 배아에있는 염료 또는 레트로 바이러스 벡터와 셀 라벨은 심장 개발 6시 세포 계통의 배아 출처에 중요한 정보를 가져왔다. 예를 들어, 고립 된 마음의 체외 배양 한 다음 생체 마우스 태아의 심장 막 공간에 주입 염료는 심 외막 세포와 그 후손 7 레이블로 사용되었다. 그러나, 염료 및 레트로 바이러스 셀 라벨은 대부분 8 더 쉽게 접근 할 수있다 여전히 제대로 개발 기관, 또는 닭의 배아와 초기 마우스 배아에 적용되었습니다. 예외가 전자의 대상으로 쉽게 뇌입니다mbryos 9,10. 이러한 접근 방식은 아직 구타 배아 마우스의 심장에 적용되지 않았습니다.
염료 또는 바이러스에 직접 라벨을 보완하기 위해보다 고급 단계의 마우스 배아와 성인 마우스의 추적 혈통을 수행하는 셀 라벨 접근 방식은 크레 / 훈제 연어 기술을 이용하여 형질 전환 생쥐의 분석과 결합되어 있습니다. 크레 / 훈제 연어 방법 (11)는 그러나 재조합 효소의 발현을 구동하는 데 사용되는 게놈 규제 지역의 시공간 특이성, 그리고 크레 / 훈제 연어 재조합 (12)의 효율성으로 인해 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 그것은 단지 크레 식을 구동하는 데 사용 규제 지역의 활성화 후 전구체에 레이블을 지정할 수 있습니다 더욱이,이 방법은 완벽하게 세포 운명의 세포 이동 구동 인수의 특정 문제를 해결하지 않습니다. 또한 분명한 윤리적 인 문제에 대해 인간 배아에 적용 할 수 없습니다.
이러한 제한을 감안할 때, 우리는 새로운 P 시리즈를 디자인의 대상 지역에서 같은 형광 염료, 바이러스 등 shRNAs와 DNA 기반의 셀 라벨 벡터로 유전자 발현 조절 자, 또는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 세포와 같은 세포 라벨링 에이전트의 다양한 주입하는 rotocols 마음.
DNA / 세포 주사는 입체 현미경과 48 시간, 또는 48 ~ 72 시간 동안 고립 된 심장이나 배아 이식편 문화까지 생체 배아 문화와 함께 간단한 미세 주입 장치를 사용합니다. 우리는 또한 자궁에 배아의 마음 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을보고합니다.이 기술은 배아 (13)의 개발을 모니터링 할 수 있으며 injectates 및 / 또는 표지 세포의 장기 추적 관찰 할 수 있습니다.
우리는 이러한 접근 방식은 장기의 기능을 보존하고 줄기 세포의 잠재력을 시험 관내 시험보다 더 대표적인 환경을 제공하는 것으로 나타났습니다. 또한, 마이그레이션을 수행 할 수있는 기회를 제공한다자신의 운명을 모니터링하는 세포를 표시 및 / 또는 주입. 궁극적으로, 이것은 지역 티슈 패터닝 및 주요 생물학적 과정의 더 나은 이해를 수득한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에서 설명한 내 심장 생체 주입 프로토콜은 중간 단계 (E9.5 – E11.5) 마우스 배아에서 최소 48 시간 동안 심근 기능을 보존하도록 설계되어 있습니다. 이러한 주입 방법은 DNA 나 세포의 공간적 대상으로 주입 할 수 있습니다. 그림 1-3에 나와있는 몇 가지 예는 생체와 같은 내막 또는 심 외막 세포의 EMT으로 제한된 심장 지역에서 개최 발달 과정의 생체 분자 메커?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 재단 Leducq (승모판)과 직원은 국립가이 연구에 자금을 지원을 위해 라 공들인 (ANR Specistem을 부여)을 부어 인정합니다.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| 기타 | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
