وسم الخلية وحقن في تطوير الجنينية الماوس قلوب
Summary
نحن تصف سلسلة من الطرق لحقن الأصباغ وناقلات الحمض النووي، والفيروسات، والخلايا من أجل رصد كل من مصير الخلية والنمط الظاهري من الخلايا الذاتية والمطعمة المشتقة من الخلايا الجنينية أو المحفزة داخل أجنة الفئران في اليوم الجنينية (E) 9.5 و مراحل لاحقة التنمية.
Abstract
اختبار مصير الجنينية أو الجذعية المحفزة الخلايا في المختبر المشتقات في بروتوكولات أدى إلى نتائج مثيرة للجدل والتي لا تعكس بالضرورة في الجسم الحي المحتملة. ويفضل، ينبغي أن توضع هذه الخلايا الجنينية في بيئة سليمة من أجل الحصول على النمط الظاهري محددة. وعلاوة على ذلك، ظلت نسب خلية تتبع الدراسات في الماوس بعد وضع العلامات الخلايا مع الأصباغ أو ناقلات فيروسات محدودة معظمها إلى أوائل أجنة الفئران المرحلة مع أجهزة تزال ضعيفة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتصميم بروتوكولات القياسية وحقن مكروي بوساطة الموجات فوق الصوتية لحقن عوامل مختلفة في المناطق المستهدفة من القلب في أجنة فئران في مراحل لاحقة E9.5 والتنمية. يزدرع الجنينية أو الأجنة ثم مثقف أو اليسار لمزيد من التطور في الرحم. وتشمل هذه العوامل الأصباغ الفلورية، فيروس، shRNAs، أو الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الاصلية. نهجنا يسمح الحفاظ على فوnction للجهاز في حين رصد الهجرة ومصير الخلايا المسمى و / أو حقن. هذه التقنيات يمكن أن تمتد إلى الأجهزة الأخرى، وسوف تكون مفيدة جدا لمعالجة المسائل الرئيسية في علم الأحياء البيولوجية للتنمية.
Introduction
منذ أكثر من عقد من الزمان، والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HuESCs) قد استمدت من مثانات بلاستولية الإنسان 1. منذ ذلك الحين، أصبحت هذه الخلايا موضوع حقل مهم من الأبحاث التي تتناول المسائل التي لم تتم تلبيتها في البيولوجيا التطورية الإنسان. وقد وفرت HuESCs علاوة على ذلك الآمال في الطب التجديدي. في السنوات الأخيرة، تم إنشاؤها الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (iPSCs) من الخلايا الجسدية المريض محددة، وتوفير نماذج من مرض وراثي 2. العديد من البروتوكولات في المختبر لتمايز الخلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة نحو مختلف الأنساب الخلية، بما في ذلك القلب الأنساب 3، تم الإبلاغ عنها. وغالبا ما phenotyped خلايا متمايزة عن طريق تحليل الحمض النووي الريبي والبروتينات التعبير، المناعية، و / أو في اختبارات الوظائف المختبر. ومع ذلك، المحفزة مشتقات الخلايا الجذعية يجب أن توضع في بيئة الجنينية المناسبة من أجل اختبار ما إذا يكتسبون تماما سلل مصير نظيرتها الجنينية وما إذا كانت ألخص في الجسم الحي وظيفة حقيقية في استجابة لمنبهات الإقليمية. بينما هندسة الأنسجة واعدة، فإنه لا يوفر بعد كل الاشارات المعروفة وغير المعروفة من السليم في الجسم الحي الأنسجة الجنينية النامية 4،5.
وسم الخلية مع الأصباغ أو ناقلات فيروسات في الأجنة، بما في ذلك أجنة الفئران، جلبت معلومات هامة فيما يتعلق بمنشأ الجنينية الأنساب الخلية أثناء التطور القلب 6. على سبيل المثال، صبغ الحقن في الفضاء التامور من أجنة الفئران فيفو السابقين، تليها الثقافة في المختبر من قلوب معزولة، وكان يستخدم لتسمية الخلايا النخابية وذريتهم 7. ومع ذلك، صبغ ووسم الخلية فيروسات طبقت معظمها لأجنة الفئران في وقت مبكر مع أجهزة تزال ضعيفة، أو أجنة الدجاج، والتي هي أكثر يمكن الوصول إليها بسهولة 8. استثناء هو الدماغ، وهو أسهل لاستهداف في البريدmbryos 9،10. لم يتم حتى الآن تطبيق هذا النهج لضرب قلب الجنينية الماوس.
لاستكمال وضع العلامات مباشرة مع الأصباغ أو الفيروس وإجراء النسب التتبع في أكثر تقدما أجنة الفئران والجرذان مرحلة الكبار، وقد تم الجمع بين نهج وضع العلامات الخلية مع تحليل الفئران المعدلة وراثيا باستخدام التكنولوجيا لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن. إلا أن نهج لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن 11 ملامح بعض القيود بسبب خصوصية الزمانية المكانية للمناطق التنظيمية الجيني يستخدم لدفع التعبير عن recombinase، وكفاءة إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية / لوكس 12. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج لا يعالج تماما الأسئلة محددة من الخلايا اقتناء يحركها هجرة مصير الخلية كما يمكن تسمية فقط السلائف بعد تفعيل المنطقة التنظيمية المستخدمة لدفع لجنة المساواة العرقية التعبير. فإنه أيضا لا يمكن أن تنطبق على الأجنة البشرية من أجل قضايا أخلاقية واضحة.
ونظرا لهذه القيود، قمنا بتصميم سلسلة من ع جديدةrotocols لحقن مجموعة متنوعة من وكلاء وسم الخلية مثل الأصباغ الفلورية، فيروس، جهري التعبير الجيني مثل shRNAs وناقلات توسيم الخلايا المعتمدة على الحمض النووي، أو الخلايا في الجنين الماوس في E9.5 ومراحل لاحقة من التنمية في المناطق المستهدفة من القلب.
حقن الحمض النووي / خلية استخدام stereomicroscope وجهاز حقن مكروي بسيطة جنبا إلى جنب مع فيفو السابقين الثقافة الجنين تصل إلى 48 ساعة، أو القلب معزولة أو الثقافة يزدرع الجنينية ل48-72 ساعة. نحن أيضا تقريرا بروتوكول حقن مكروي بوساطة الموجات فوق الصوتية في قلوب الماوس الجنينية في الرحم، وهذا الأسلوب يسمح رصد تطور الأجنة 13 ويسمح على المدى الطويل متابعة من injectates و / أو الخلايا المسمى.
وجدنا أن هذه المناهج الحفاظ على وظيفة الجهاز وتوفير بيئة أكثر من ممثل في المختبر اختبار إمكانات الخلايا الجذعية. كما يوفر الفرصة لمتابعة الهجرةمن وصفت و / أو حقن خلايا لرصد مصيرهم. في نهاية المطاف، وهذا ينبغي أن تسفر عن فهم أفضل للتنميط الأنسجة الإقليمية والعمليات البيولوجية الرئيسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم السابقين بروتوكولات حقن الجسم الحي داخل القلب المذكورة أعلاه للحفاظ على وظيفة عضلة القلب لمدة 48 ساعة على الأقل في منتصف مرحلة (E9.5-E11.5) أجنة الفئران. هذه الأساليب تسمح للحقن حقن استهدفت مكانيا من الحمض النووي أو الخلايا. وبعض الأمثلة هو مبين في ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف واضعو Leducq مؤسسة (التاجي) والوكالة الوطنية صب لا بحوث (منح وكالة الاستخبارات الوطنية Specistem) لتمويل هذا البحث.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| 기타 | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
