Summary
אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.
Abstract
בדיקת גורלם של תאי גזע עובריים או נגזרי pluripotent במבחנת פרוטוקולים הובילה לתוצאות שנויות במחלוקת, שאינו משקפים בהכרח in vivo את הפוטנציאל שלהם. רצוי, צריכים להיות ממוקמים בתאים אלה בסביבה עוברית תקינה על מנת לרכוש פנוטיפ מובהק שלהם. יתר על כן, שושלת תא התחקות מחקרים בעכבר לאחר סימון תאים עם צבעים או וקטורי רטרווירלי נשארה מוגבלת בעיקר לעוברי עכברים בשלב מוקדם עם איברים עדיין מפותחים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, עיצבנו פרוטוקולי microinjection סטנדרטיים ותיווך אולטרסאונד כדי להזריק סוכנים שונים באזורים הממוקדים של הלב בעוברי עכברים בE9.5 ושלבים מאוחרים יותר של התפתחות. explant או עוברים עובריים בתרבית ואז או שמאלה כדי לפתח עוד יותר ברחם. סוכנים אלה כוללים צבעי ניאון, וירוס, shRNAs, או תאי גזע ובתאים שמקורם בתא. הגישות שלנו מאפשרות לשימור של פוnction של האיבר תוך מעקב הגירה וגורלם של תאים שכותרתו ו / או בזריקה. ניתן להאריך בטכנולוגיות אלה לאיברים אחרים ויהיה מועיל מאוד כדי לענות על שאלות ביולוגיות מרכזיות בביולוגיה של התפתחות.
Introduction
לפני יותר מעשור, בתאי גזע עובריים אנושיים (HuESCs) כבר נגזרו מבלסטוציטים אנושי 1. מאז, תאים אלה הפכו את הנושא של תחום חשוב של מחקר המתייחס לשאלות שלא סופקו בביולוגיה התפתחותית אנושית. HuESCs לי יתר סיפק תקוות ברפואת רגנרטיבית. בשנים האחרונות, תאים אנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) כבר נוצרו מהתאים סומטיים מטופל ספציפי, המספקים מודלים של מחלה גנטית 2. רבים בפרוטוקולי מבחנה להתמיינות של תאי גזע pluripotent עובריים או מושרה כלפי שושלות תאים שונות, כוללים שושלות לב 3, כבר דיווח. התאים מובחנים לעתים קרובות phenotyped על ידי ניתוח של RNA וביטוי חלבון, immunostaining, ו / או בבדיקות תפקודיות מבחנה. עם זאת, נגזרים בתאי גזע pluripotent צריך להיות ממוקם בסביבה עוברית תקינה על מנת לבדוק אם הם רוכשים את cel מלאגורל ליטר של עמיתו העוברי שלהם ובין אם הם לשחזר את התפקוד vivo באמיתי בתגובה לאותות אזוריות. בעוד הנדסת רקמות היא מבטיח, זה עדיין לא מספק את כל הרמזים ידועים ובלתי ידועים של הראוי in vivo מתפתחים רקמה עוברית 4,5.
תא תיוג עם צבעים או וקטורי רטרווירלי בעוברים, לרבות עוברי עכברים, הביא מידע חשוב באשר למקור העוברי של שושלות תאים במהלך התפתחות לב 6. לדוגמא, לצבוע הזרקה אל תוך חלל קרום הלב של עוברי עכברי vivo לשעבר, ואחריו תרבות במבחנה של לבבות בודדים, שימש לתווית תאי epicardial וצאצאיהם 7. עם זאת, צבע ותיוג תא רטרווירלי כבר מיושמים בעיקר לעוברי עכברים מוקדמים עם איברים עדיין מפותחים, או עוברי עופות, שהם יותר נגישים בקלות 8. יוצא מן הכלל הוא במוח, שהוא קל יותר למקד בדוארmbryos 9,10. גישה כזו טרם יושמה אל לב העכבר העוברי הפועם.
כדי להשלים את התיוג ישיר עם צבעים או וירוס ולבצע שושלת התחקות בעוברי שלב מתקדמים יותר בעכבר ועכברים בוגרים, גישת תיוג תא כבר בשילוב עם ניתוח של עכברים הטרנסגניים באמצעות טכנולוגית Cre / לקס. גישת Cre / קס 11 עם זאת תכונות מסוימות מגבלות עקב הספציפיות spatiotemporal של אזורי רגולציה גנומית להשתמש בכונן ביטוי של recombinase, ואת היעילות של רקומבינציה Cre / קס 12. יתר על כן, גישה זו אינה מתייחסת באופן מלא על השאלות הספציפיות של רכישה מונעת נדידת תאים של גורל תא כפי שהוא יכול רק לתייג מבשר לאחר ההפעלה של אזור הרגולציה להשתמש בכונן ביטוי Cre. כמו כן, לא ניתן להחיל על עוברים אנושיים לסוגיות אתיות ברורות.
בהתחשב במגבלות אלה, עיצבנו סדרה של p החדשrotocols להזרים מגוון של סוכני תיוג תא כגון צבעי ניאון, וירוס, מאפנני ביטוי גנים כגון shRNAs ווקטורי תיוג תא מבוסס ה-DNA, או בתאים בעובר של העכבר בE9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח באזורים ממוקדים של לב.
זריקות ה-DNA / התא להשתמש סטראו ומכשיר microinjection פשוט בשילוב עם vivo לשעבר תרבות עובר עד 48 שעה, או לב מבודד או תרבות explant עוברית ל48-72 שעה. גם אנו מדווחים פרוטוקול microinjection תיווך אולטרסאונד בלב העוברי של עכברים ברחם. טכניקה זו מאפשרת ניטור הפיתוח של עוברים 13 ומאפשרת מעקב ארוך טווח של injectates ו / או תאי שכותרתו.
מצאנו כי גישות אלו לשמר את התפקוד של האיברים ולספק סביבה ייצוגית יותר מאשר בדיקה במבחנה של פוטנציאל של תאי גזע. הוא גם מספק את ההזדמנות כדי לעקוב אחר נדידהכותרתו של ו / או הזריק תאים כדי לפקח על גורלם. סופו של דבר, זה אמור להניב הבנה טובה יותר של דפוסים רקמה אזוריים ותהליכים ביולוגיים מרכזיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה
נהלי בעלי חיים
לקבל אישור מועדת אתיקה של בעלי חיים ופעל בהתאם להנחיות מוסדיות לעבודה עם וירוס, HuESC ו / או iPSC (כאשר רלוונטי), כמו גם טיפול בעכבר, קבלת עוברי עכברים, וביצוע ניתוחי עכבר. להזדווגויות מתוזמן, היום של התקע נחשב יום עוברי 0.5 / 0.5 ימים לאחר coitum-(E).
- מחטי Microinjection:
עבור לשעבר רחם microinjection, למשוך טפטפות זכוכית (צינורות נימי ורוסיליקט הקוטר חיצוניים 1.2 מ"מ) באמצעות חולץ פיפטה / beveller לקבל מיקרומטר קוטר 1 או 10 פנימי קצה וצורת קצה חדה וחרוטים להזריק DNA או תאים, בהתאמה. זריקות בתיווך אולטרסאונד, שימוש מותאם אישית מחטים סטריליות, אשר יש קוטר חיצוני / פנימי (OD / ID) של 1.14 mm/0.53 מ"מ, עם טיפ 50/35 OD מיקרומטר / זהות. - צלחות פטרי מלאות סיליקון:
הכן סיליקון כפי שמתואר במדריך. למלאצלחת פטרי זכוכית נקייה 60 קוטר מ"מ עם שכבת אלסטומר של ~ 1 סנטימטר. למנוע בועות אוויר. - מכשירים:
שמור את כל מכשירי ניתוח סטרילי לפני ובמהלך ההליך. - הכנת ה-DNA:
הוסף 3 DNA מיקרוגרם ו12 μl Opti-ממ בצינור אחד. הוסף 3 Lipofectamine μl 2000 ו12 μl Opti-ממ בצינור אחר. דגירה במשך 5 דקות ב RT ולערבב את שני הפתרונות. השתמש באופן מיידי. - הכנת תא:
הכן השעיה של 10 6 תאים / מיליליטר DMEM (של Dulbecco נשר בינוני, גלוקוז גבוה ו50% בסרום חולדה). 50 μl של השעיה תא הסופית הוא מספיק ל8-10 עוברים. - לצבוע הכנה:
השתמש בניאון הירוק CDCFDA-SE ב25 מ"ג / מיליליטר DMSO. הכן 20 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C. לדלל 1:100 / 1:200 בתמיסת מלח או PBS סטרילי לפני השימוש. - הכנת וירוס:
השתמש-GFP-לבטא PGK lentivirus דור 3 rd מסחרי עם כייל של ~ 10 9 -10 10 טרהnsducing יחידות / מיליליטר DMEM. להכנת lentivirus, ראה Tiscornia et al. 14 ללבוש ציוד מגן אישי ולהשתמש בבטחה ובלהיפטר מנגיף.
2. אוסף של E9.5 וE10.5 עוברים לvivo הזרקה אקס
- להרדים עכבר בהריון ביום עוברי 9.5 או 10.5.
- לעקר את החזה והבטן של העכבר עם 70% אתנול.
- ביצוע חתך קו האמצע הגחון כדי לפתוח את הבטן ולאחזר את קרן הרחם ב RT ב-PBS ולהעביר אותו אחרי שני שוטף PBS לצלחת פטרי המלא בסיליקון עם מדיום M16.
- הצמד את קרן הרחם עם סיכות חרקים לשכבת סיליקון כך שצד vascularized של הרחם הוא בתחתית.
- חותכים את פני השטח של הרחם עם מלקחיים בסדר, וכובע של decidua ב1 מ"מ מתחת לפני השטח.
- בעדינות לשלוף את העובר בצק החלמון ע"י פרישת קירות decidua.
- אחסן את העוברים על 37 מעלות; C בM16 בינוני לפני הזרקת תא. להזרקה, כל עובר מועבר לצלחת סיליקון מלאה בינוני M16 מראש חימם על 37 ° C.
3. DNA או הזרקת תאים תחת סטראו
- למלא את פיפטה הזכוכית מהחלק האחורי עם מזרק המילטון ולנער את פיפטה כדי להסיר בועות בקצה.
- הגדר את פיפטה על בעל microinjection; להגדיר את הלחץ החזק ל50 (DNA) או 30 (תאים) hPa, ולחץ ההזרקה 150 ל( DNA) ל300 (תאים) hPa. קבע את זמן הזרקה ל0.2 שניות (DNA) או 0.5 שניות (תאים). הגדרות אלה עשויות להשתנות מעט בהתאם לסוג של microinjector ופיפטה.
- הצמד את העובר לתחתית סיליקון דרך שק החלמון בלי לגעת בעובר התקין. צפה באזור של הלב ולפתוח את השק רק מעל אזור זה.
- הוסף 4 סיכות סביב העובר כדי למנוע כל תנועה במהלך הזרקת תא.
- שימוש micromanipulator (למצב ידני), slowlמיקום Y קצה פיפטה בזווית של ° 45 מעל קרום הלב, בדיוק מעל האזור של הלב שהוא להיות מוזרקים (איור 1).
- הזז את פיפטה לתוך האזור של עניין ולעורר את הזריקה. קח את פיפטה מהר ככל האפשר. ודא הלב פועם כהלכה לאחר הזרקת ה-DNA / תא.
4. עובר, לב מבודד, וexplant תרבות
- תרבות עוברי E9.5 ב25% בינוניים M2 ו75% בסרום עכברים, השלימו עם פניצילין / סטרפטומיצין, מראש חימם על 37 מעלות צלזיוס וחומצן עם 40% O 2.
- הוסף 2 מדיום תרבות מיליליטר בשפופרת זכוכית 25 מיליליטר, בעדינות להוסיף את העובר, וחמצן עם 40% O 2 לפני הברגת הכובע על הצינור. דגירה עד 36 שעות על 37 מעלות צלזיוס בעוד סיבוב או טלטול (30 סיבובים / min).
- בנקודת הזמן הרצויה (למשל 24hr), לנתח את לבם בזהירות עם מלקחיים בסדר, בלי לגעת בלבם, על ידי דה הראשוןcapitating העוברים; הלב הוא קל לבלו על ידי משייכתו החוצה באמצעות מערכת יצוא דיסטלי.
- תרבות מבודדת לב עבור שעות נוספות 36-48 DMEM עם FCS 50% על הוספת Matrigel מצופה נקבעה ב12 גם צלחת. ראה דאייר ופטרסון (2013) לפרוטוקול משופר של לב תרבות 15.
- בצע את כל explant של האזור של עניין. כדוגמא, לנתח את תעלת atrio-חדרית (AVC) ותרבותה ל48 שעות על קולגן סוג 1 ג'ל 16.
5. הזרקה מונחה אולטראסאונד שבלב n רחם
- התקנה של מכשיר אולטרסאונד וmicroinjector:
- שימוש במערכת אולטרה סאונד ברזולוציה גבוהה עם מתמר 40 MHz והתקנת microinjection על מעקה.
- קבע את עוצמת הזריקה על microinjector ב69 NL לכל זריקה. ראה מדריך לmicroinjection של היצרן עבור תכנות microinjector.
- הכנת microiהתקנת njection והזרקה:
- הנח micropipette זכוכית בmicroinjector. כדי להבטיח הזרקה, מעיל ראשון יעיל בצד הפנימי של פיפטה עם שמן מינרלים על ידי aspirating עד הנפח המקסימאלי. ואז להוציא את השמן שוב, ומשאיר 1-2 מ"מ של שמן בתוך המחט.
- לשאוב injectate עד לעצמה המרבית. היזהר שלא לגעת במשטחים עם קצה המחט כמו זה יהיה להקהות את החוד ולעשות זריקה קשה יותר.
- כדי לייצב את קרן הרחם המכילה את העוברים במהלך הזרקה, השתמש בצלחת פטרי עם הותאם חור באמצע (2.5 ס"מ קוטר), מכוסה על ידי קרום סיליקון דק עם שסע קטן לחתוך במרכז, ולמקם אותו מעל אתר החתך . לייצב את צלחת פטרי על שולחן הטיפול של עכבר על ידי מיקום 3-4 גושים של חימר מתחת לשולי הצלחת.
- הליך הזרקה:
- לגלח את הבטן של עכבר בהריון (בשלב העוברי הרצוי) לפני anestheSIA להסרת שיער. פנק את הבטן עם סוכן הסרת שיער כימי להסרת שיער שייר ולחטא עם 70% אתנול.
- הרדימי עכבר בהריון עם החמצן / isoflurane באמצעות מסיכת הפנים. השתמש isoflurane 3-5% ב100% חמצן להרדמה ראשונית, ואחריו 1-1.5% במהלך השאר של ההליך. ודא שהעכבר הוא מורדם כראוי על ידי בעדינות צובט כפות ו / או בזנבו.
- מקם את עכבר פרקדן על שולחן הטיפול של עכבר (שנקבע לחום על 37 מעלות צלזיוס) ולכסות את העיניים עם חומר סיכה על מנת למנוע התייבשות של הקרנית.
- החל ג'ל האלקטרודה על האלקטרודות וידביק את כפות לאלקטרודות כדי לפקח על קצב לב, קצב נשימה, ואק"ג. מקם מדחום רקטלי כדי לפקח על טמפרטורת גוף.
- ודא תחילה שהעכבר הוא בהריון על ידי הדמיה וסופר את העוברים על ידי אולטרסאונד. החל ג'ל אולטרסאונד על הבטן ומקם את סריקת הראש מעל לשלפוחית השתן. לשם עקביות, לדמיין את שלפוחית השתן ראשון,ולספור עוברים בצד השמאל וקרן רחם תקין, החל מהעמדה של שלפוחית השתן. ודא שלב עוברי מכה כרגיל.
- אם העכבר הוא בהריון, מקם את צלחת פטרי מעל אתר חתך העתיד עם חימר. לחץ על הצלחת מעט על הבטן, כך שהמנה היא במגע ישיר.
- הסר את הצלחת ולעקר את הבטן שוב. ביצוע חתך קו האמצע הגחון 1.5-2 סנטימטר, כ 0.75-1 ס"מ מעל הנרתיק, כדי לפתוח את הבטן והצפק. הימנע מפגיעה באיברים פנימיים.
- Exteriorize השמאל או קרן רחם תקין עם מלקחיים, בעדינות למשוך אותו דרך קרום סיליקון של המנה, ולייצב את הצלחת על החימר שוב. למנוע נרחב מושכים או מניפולציה, שכן דבר עלול לגרום לדימום של כלי הרחם והמוות בטרם עת של האישה ו / או עובר.
- לספור את העוברים שוב על מנת להבטיח רישומים נאותים של עוברים שהוזרקו.
- החל ג'ל אולטרסאונד על uקרנות terine לתמונת הלב ועל מנת למנוע התייבשות.
- תמונת העובר הראשון שהוזרק. בדקו מכות נורמליות של הלב העוברי ולשמור תיעוד של את כיוון הגולגולת, הזנב ושמאל וימין של העובר. במידת צורך, למקם מחדש את קרן הרחם מעט כדי להבטיח כיוון נכון. אם זה מוכיח קשה, על מנת להעביר את העובר הבא.
- לנקב את הרחם בזהירות עם מחט microinjection כדי למקם את המחט בזווית של ° 45 מעל העובר, מעט מחוץ לקרום הלב (איור 3). לתיוג של תאי epicardial, תמונת הלב בארבעה חדר תצוגה ולמקם את המחט כך שיצביע לכיוון חריץ atrio-חדרית (איור 3). אם הזווית צריכה להיות מותאמת, לשלוף את המחט, ולמקם מחדש. לא להתאים את הזווית עם המחט בתוך הרחם, שכן זה עלול לשבור את המחט. למנוע ניקוב רקמות אחרות, כגון גפיים או שליה.
- להזיז את המחטעל קיר קרום הלב ולנקב אותו עם תנועה עדינה, אבל מהירה. באופן כללי, לא תהיה התנגדות מסוימת, אבל הזזת המחט מהר מדי עלולה לגרום לקצה המחט לנקב את הלב עצמו. טיפ צריך בסופו של דבר בחלל קרום הלב של גרוב atrio-חדרית. במקרה של דימום קרום הלב, תאי דם יהיו גלויים כתבנית כמו שלג לבנה. אם זה המקרה, להפסיק להזריק את העובר ולעבור לעובר אחר.
- הזרק injectate. הזרק מקסימאלי 700 NL אל תוך חלל קרום הלב כדי למנוע השפעה שלילית על התפתחות לב. לפקח על ההזרקה הנכונה על ידי נפיחות קלה, זמנית של שק קרום הלב.
- לאחר הזרקה, למשוך את המחט החוצה ולאשר כי injectate עדיין יכול להיפלט כדי להבטיח שהמחט לא הייתה סתומה על ידי ברי רקמה.
- למקם מחדש את שולחן טיפול לתמונה ולהזריק את העובר הבא. שמור את מספר העוברים המוזרקים למקסימאליים 3-4 (בקרן רחם אחת) כדי למנועהרחיב את ההרדמה, כדי לאפשר לעוברי שליטה בקרן הרחם מתנגדת, וכדי להבטיח שההליך לא הפריע התפתחות עוברית.
- לאחר שהזריק את המספר הרצוי של עוברים, להסיר ג'ל אולטרסאונד העודף ומניח בעדינות את קרן הרחם בחזרה לתוך הבטן בתנוחה הנכונה.
- סגור את הבטן האימהית באמצעות שכבה אחת של תפר להצפק ואת שרירי בטן, ושכבה שנייה של תפר לעור.
- הזרק את העכבר עם המנה הראשונה של תרופות לשיכוך כאבים. השתמש בזריקה אחת של 0.05-0.1 דקות מ"ג / קילוגרם עצירות 15 לפני סיום הרדמה ושלוש זריקות נוספות עם 12 מרווחי שעה.
- להפסיק את ההרדמה ולנטר את העכבר להתאוששות נאותה מההליך. בית העכבר בהריון בכלוב נפרד למשך הרצוי של מעקב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בפרוטוקולי ההזרקה שתוארו לעיל, יכולים להיות מתויגים תאים ו / או מוזרק ללב העכבר העוברי. כהוכחה של מושג, כמה דוגמאות מוצגות בי פרוטוקול ההזרקה וvivo לשעבר explant AVC, לב מבודד, או תרבות עובר כולו אוחדו (איור 1).
איור 1 מציג את ההכנה של העובר לפני הזרקת תא. עובר E9.5 מוסר מdecidua, תוך שמירה על שלמות (איור 1 א) שק חלמון. שק החלמון נפתח בדיוק מעל הלב (איור 1). פיפטה הוא התקרב (איור 1 ג) והתאים מוזרקים. הלב שומר על צורתה (איור 1D) ועוד מכות.
כדי לתת מענה לשאלה ביולוגית ספציפית יותר בביולוגיה התפתחותית, כגון אפיתל לmesenchyme מעבר (EMT), explant E9.5 AVC הזריק shRNA שלמטה מסדיר חלבון דרוש למעבר אנדותל-mesenchymal של תאי endocardial (איור 2 א). עובר השליטה הוזרק עם וקטור עמוד השדרה ריק. כמו כן, תאי גוונים שמקורן בתאי אנדותל מראש מסתמית להביע GFP תחת השליטה של אמרגן Sox9 הוזרקו בAVC בE10.5, ואחריו 48 תרבות לב hr explanted. תאים אלה לרכוש סמנים של EMT כגון periostin דומה לתאי endocardial אנדוגני (2B דמויות ו2C).
vivo לשעבר גישות אלה הן קלים יחסית, אך מוגבלים למעקב לטווח קצר (מקסימאלי 48-72 hr). הליך הזרקת אולטרסאונד מונחה מספק גישה מבחינה טכנית יותר מאתגר, אבל עם האפשרות של טווח ארוך, גם לאחר לידה, ברחם מעקב. ההזרקה ברחם של צבע או וקטורים ויראליים לתייג תאים באזורי לב ספציפיים מוצגת איורים 3A-3 C. בשיטה זו, תיוג ספציפי של תאי epicardial ניתן להשיג עם צבעי ניאון (3D דמויות ו3E) או וירוס (איור 3F), ואת השיטה ניתן להרחיב עליה עם תאים או injectates החלופי.
. איור 1 הזרקת תאים בלב:.. עובר E9.5 בצק החלמון ב ': הדמיה של הלב לאחר פתיחת שק החלמון ממש מעל הלב. הבלעה להלן מציגה הגדלה של הלב ומצביעה תעלת AV C:. הגישה של פיפטה כלפי AVC D:. הזריק עובר אחרי תרבות שעות 48 (H = לב).
תוכן-width = "6in" עבור: src = /> "/ files/ftp_upload/51356/51356fig2highres.jpg" = "/ files/ftp_upload/51356/51356fig2.jpg" src
. איור 2 הזרקה של shRNA בAVC של עובר E9.5 שמונע vivo EMT לשעבר של תאי endocardial בexplant לב:. וקטור עמוד השדרה שליטה או shRNA הוזרקה יחד עם lipotectamine בAVC של E9.5 עובר של עכבר; 3 שעות מאוחר יותר, AVC היה גזור החוצה וגדל על ג'ל קולגן כדי לעורר EMT של תאי endocardial. ShRNA downregulated חלבון שנדרש לEMT לפנה"ס:. תאים מסתמית גוונים שמקורן בתאים הונדסו GFP תחת השליטה של אמרגן Sox9 הוזרקו בAVC של עוברי E10.5. הלב היה בתרבית למשך 2 ימים (ב '), ובהמשך קבוע ומוכתם עם נוגדן אנטי periostin (C). הבלעה מראה הגדלה של אזור AVC.
e = "תמיד"> 
.. איור 3 בהזרקת רחם: ערכה המתארת את ההתקנה הניסיונית. העכבר בהריון נמצא בעמדת פרקדן וצלחת פטרי עם קרום סיליקון הוא התייצב מעל אתר החתך. . 1 = microinjector, 2 = מתמר, 3 = צלחת פטרי עם קרום סיליקון, 4 = ג'ל אולטרסאונד, 5 = עכבר עם קרן רחם (אדום), 6 = חימר פלסטלינה, 7 = שולחן הטיפול של עכבר ב ': עדיין מסגרת של סרט אולטרסאונד (מצב M) מראה את המיקום של המחט ולב עוברי לפני הזריקה. נקבת א.ק.ג. מוצג בתחתית (הירוק), ולב וקצב נשימה בפינה הימנית התחתונה (הצהובה). H = לב C:. תמונת אולטרסאונד המראה את המיקום של המחט ולב עוברי במהלך הזרקה. הבלעה: הקצה עבר את קרום הלב, אבל לא נוגע בשריר הלב, כך שלהזריקאכלתי יהיה ניתן להזריק לתוך חלל קרום הלב של גרוב atrio-חדרית. קווים מקווקווים שחורים לסמן את הגבולות של אטריום () והחדר (V) D:. הר שלם תמונה של עובר עכבר E11.5 מראה הקרינה חזקה של הצבע בחלל קרום הלב E:. סעיף נציג E11.5 לב עכבר עוברי מראה תיוג תא קרום הלב וepicardial עם פלורסנט לצבוע (CDCFDA-SE, ירוק) 4 שעות לאחר הזרקה. גרעינים מסומנים עם DAPI (כחול). LA = פרוזדור שמאלי, LV = חדר השמאלי, RA = עלייה ימנית, RV = חדר ממני F:. קטע מייצג של לב עכבר עוברי E14.5 מראה תיוג פסיפס epicardial תא עם lentivirus-GFP-לבטא 3 ימים לאחר ההזרקה. כדי לאשר את הספציפיות ה-GFP, חלבון ה-GFP גם מוכתם עם נוגדן ה-GFP (אדום). גרעינים מסומנים עם DAPI (כחול).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לשעבר פרוטוקולי ההזרקה תוך לב vivo שתוארו לעיל נועדו לשמור על תפקוד שריר הלב לפחות 48 שעות באמצע הבמה עוברים (E9.5-E11.5) עכבר. הזרקת גישות אלה מאפשרים להזרקה ממוקדת במרחב של ה-DNA או תאים. כמה דוגמאות שמוצגים איורים 1-3 לספק הוכחה של קונספט להתוויית vivo לשעבר ובמנגנונים מולקולריים vivo של תהליכים התפתחותיים המתרחשים באזורים של הלב מוגבלים, כגון EMT של תאי endocardial או epicardial. והכי חשוב, פרוטוקולים אלה מספקים הזדמנות לעקוב הגירה וגורלם של תאים מוזרקים כגון תאים עובריים אנושיים או נגזרי huESC בסביבה עוברית תקינה, עד כה לא סופקו אתגר. בvivo תיוג (כמו התאים epicardial באיור 3) עם להרוות או הגבלת דילולים של צבע או וירוס מאפשרת להתחקות שושלת של תא אוכלוסיות (משנה) בב ארוך טווח קצר כמו גםאס, ללא הצורך בטכנולוגית Cre / לקס (אם כי שילוב של טכניקות אלה עשויים להיות שימושיים גם כן).
כמה שלבים קריטיים תוך יישום הפרוטוקולים הללו נצפו. ראשית, את העוברים רגישים מאוד לאור. לכן מומלץ לתרגל את פרוטוקול הזריקה מתחת סטראו, כך שההליך יכול להתבצע עם שחזור גבוה ויעילות בתוך 15 דקות לכל עובר. באותה השורה, בכל הליך ההזרקה בתיווך אולטרסאונד צריך להתבצע בתוך 30 דקות כדי לשמר את כדאיות טובה של עוברים ולא להתפשר ברחם ההתפתחות שלהם. מניפולציה של הרחם צריכה להישמר עד למינימום. בנוסף, יש לציין כי ניתוח על עכברים בהריון נוטה לגרום ללידה מוקדמת (1-2 ימים מוקדם יותר מהרגיל). עם זאת, ילודים צריכים להיות בריאים באופן כללי ולהתפתח באופן נורמלי. יתר על כן, החדירה של פיפטה דרך דופן הרחם, שק החלמון ואת העוברלהגיע קרום הלב ולבסוף שריר הלב הוא הליך עדין (שלב 5.3.13). צעד זה צריך להיעשות בזהירות ובעדינות. לאופטימיזציה, מומלץ לבצע כמה זריקות צבע לטווח קצר כדי לקבוע את שחזור ולהוציא הזרקה באזורים שאינם ממוקדים. לבסוף, לא מצאו פגמים לב התפתחותיים הקשורים לנהלי הזרקה לדוגמות שניתנו לעיל. עם זאת, יותר מפורט, שלב אחר שלב, ניתוח מורפולוגי ופונקציונלי יש לבצע כדי לוודא לחלוטין התפתחות ותפקוד נורמלים בשלבים של עניין.
המגבלות של טכנולוגיות אלה הן כמה. (I) הזריקה מתחת לסטראו הוא מוגבלת על ידי הרגישות לאור וטמפרטורה של עוברי העכברים. זו ניתן להתגבר על ידי התרגול של הליך microinjection כדי להיות מהיר ככל האפשר, והחליף באופן קבוע או התחממות בינונית, ועובד בחדר חשוך. (Ii) v לשעברתרבות איבו של עוברים או explants מוגבל בזמן, בניגוד להזרקה ברחם אולטרסאונד מונחה, המאפשרת מעקב ארוך טווח. צבעים חיוניים נוטים לתייג תאים באופן כמעט מיידי ונשארים גלוי עד שלושה עד ארבעה ימים לאחר הזרקה. עם זאת, עוצמת הצבע תהיה מדוללת על ידי חלוקות תא רצופות. תיוג תאים עם lentivirus עשויה להתגבר על בעיה זו. עם זאת, ספיגה של הנגיף לוקחת כמה שעות והביטוי הוא אופטימלי לאחר 24-48 שעה, המונעת ניתוח לטווח קצר. (Iii) ההזרקה בתיווך אולטרסאונד היא מוגבלת על ידי העלות של הציוד. ברזולוציה של מתמר 40 MHz מספיק לאמצע ועוברים בשלב מאוחר, אך יותר מגבילה עבור שלבים לפני E11.5.
לסיכום, אנו מציעים כי יש להשתמש בפרוטוקולי הזרקת הלב שתוארו לעיל בעוברי עכברים באמצע הבמה. Vivo לשעבר הטכניקה תואמת את התרבות של עוברים, לבבות בודדים, או explants. In vivo ההליך מאפשר מעקב ארוך טווח, ובכלל זה פיתוח שלאחר לידה. טכניקות אלה יסייעו באופן משמעותי בבדיקת פוטנציאל ההתמיינות של תאי גזע אנושיים נגזרים בסביבה ראויה, כמו גם בהתמודדות עם שאלות ספציפיות של ביולוגיה התפתחותית, כגון נדידת תאים ורמזים אזוריים, שהם אירועים מרכזיים בדרך לעיצובו של לב פונקציונלי . בנוסף, השיטות שלנו ושל אחרים 10 עשויות בעתיד לשמש לחקירה של איברים אחרים מאשר הלב, תלויים לשעבר פרוטוקולים זמינים vivo תרבות ו / או שלב התפתחותי in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים הקרן Leducq (מיטרלי) וNationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר (מענק ANR Specistem) למימון מחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
