Cell Märkning och Injektion i utvecklings Embryonala Mus Hearts
Summary
Vi beskriver en rad metoder för att injicera färgämnen, DNA-vektorer, virus och celler i syfte att övervaka både cell öde och fenotyp av endogena och transplanterade celler från embryon eller pluripotenta celler i musembryon på embryonala dag (E) 9.5 och senare skeden av utveckling.
Abstract
Testa öde embryon eller pluripotenta stamceller-derivat i in vitro-protokoll har lett till kontroversiella resultat som inte nödvändigtvis speglar deras in vivo-potential. Företrädesvis bör dessa celler placeras i en lämplig embryonal miljö i syfte att förvärva sin definitiva fenotypen. Dessutom har cellens härstamning spåra studier i musen efter märkning av celler med färgämnen eller retrovirusvektorer förblev mestadels begränsad till tidigt skede musembryon med fortfarande dåligt utvecklade organ. För att övervinna dessa begränsningar, utformade vi standard-och ultraljud-medierad mikroinjektion protokoll för att injicera olika ämnen i utvalda regioner i hjärtat i musembryon vid E9.5 och senare stadier av utveckling. Embryonala explant eller embryon odlas sedan eller vänster för att ytterligare utvecklas i livmodern. Dessa medel innefattar fluorescerande färgämnen, virus, shRNAs eller stamcellshärledda progenitorceller. Våra metoder kan för bevarandet av helanktion av orgeln medan övervakningen migration och öde märkta och / eller injicerade cellerna. Dessa tekniker kan utsträckas till andra organ och kommer att vara till stor hjälp för att ta itu med viktiga biologiska frågor inom biologi utveckling.
Introduction
Mer än ett decennium sedan, har humana embryonala stamceller (HuESCs) härstammar från mänskliga blastocyster 1. Sedan dess har dessa celler blivit föremål för ett viktigt forskningsområde som behandlar otillfredsställda frågor i människans utvecklingsbiologi. HuESCs har dessutom förutsatt hopp inom regenerativ medicin. Under de senaste åren har mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) genererats ur patientspecifika somatiska celler, ger modeller för genetisk sjukdom 2. Många in vitro-protokoll för differentiering av embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller mot olika cellinjer, inklusive hjärt linjerna 3, har rapporterats. De differentierade cellerna ofta phenotyped genom analys av RNA-och proteinuttryck, immunfärgning och / eller in vitro-funktionella test. Men pluripotenta stamceller derivat måste placeras i en lämplig embryonal miljö för att testa om de fullt ut förvärva cell öde deras foster-motsvarighet och om de rekapitulera det genuina in vivo-funktion som svar på regionala ledtrådar. Även vävnadsteknik är lovande, inte ännu ge det alla kända och okända signaler av rätt in vivo utvecklings embryonal vävnad 4,5.
Cellmärkning med färgämnen eller retrovirusvektorer i embryon, inklusive musembryon, har fört viktig information om den embryonala ursprung cell linjer under hjärt utveckling 6. Exempelvis dye injektion i perikardiell utrymmet av musembryon ex vivo, följt av in vitro-odling av isolerade hjärtan, användes för att märka epikardiella celler och deras avkomma 7. Men färg och retroviral cell märkning har främst tillämpats på tidiga musembryon med fortfarande dåligt utvecklade organ, eller kycklingembryon, som är mer lättillgängliga 8. Ett undantag är hjärnan, som är lättare att rikta in embryos 9,10. Ett sådant tillvägagångssätt har ännu inte tillämpats på det slå embryonala mus hjärta.
För att komplettera direkt märkning med färgämnen eller virus och utföra härstamning spåra i mer avancerade scen musembryon och vuxna möss, har det tillvägagångssätt cellmärkning kombinerats med analys av transgena möss med hjälp av Cre / Lox-teknik. Cre / Lox metod 11 har dock vissa begränsningar på grund av den spatiotemporal specificiteten för de genomiska regulatoriska regioner som används för att driva uttrycket av rekombinaset, och effektiviteten av Cre / Lox rekombination 12. Vidare innebär detta tillvägagångssätt inte helt motverka specifika frågor av cellmigration driven förvärv av cell öde som det bara kan märka en prekursor efter aktivering av den reglerande regionen för att driva Cre uttryck. Det kan inte heller tillämpas på mänskliga embryon av uppenbara etiska frågor.
Med tanke på dessa begränsningar, konstruerade vi en rad nya protocols att injicera en mängd olika cellmärkningsmedel såsom fluorescerande färgämnen, virus, genuttryck modulatorer såsom shRNAs och DNA-baserad cellmärkning vektorer, eller celler i musen embryot vid E9.5 och senare stadier av utveckling i utvalda regioner i hjärta.
De DNA / cell injektioner använder ett stereomikroskop och en enkel mikroinjektion anordning i kombination med ex vivo embryokultur upp till 48 timmar, eller isolerade hjärta eller embryonala Explantation kultur för 48-72 timmar. Vi rapporterar också ett ultraljud-medierad mikroinjektion protokoll i mus embryonala hjärtan i livmodern. Denna teknik gör det möjligt att följa utvecklingen av embryon 13 och möjliggör långsiktig uppföljning av injectates och / eller märkta celler.
Vi fann att dessa metoder bevara funktionen hos organ och ge en mer representativ miljö än in vitro-testning av stamcellspotential. Det ger också möjlighet att följa migrationenav märkt och / eller injicerade cellerna att övervaka deras öde. Ytterst bör detta ge en bättre förståelse av den regionala vävnads mönstring och viktiga biologiska processer.
Protocol
Representative Results
Discussion
De Intrakardiella ex vivo injektion protokoll som beskrivs ovan är utformade för att bevara hjärtmuskelfunktion i minst 48 timmar i mitten av scenen (E9.5-E11.5) musembryon. Dessa injektions metoder möjliggör rumsligt målinriktad injektion av DNA eller celler. De få exempel som visas i figur 1-3 ger bevis på konceptet för att avgränsa ex vivo och in vivo molekylära mekanismer av utvecklingsprocesser som sker i begränsade hjärt regioner, till exempel EMT av endokar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner stiftelsen Leducq (mitralis) och Agence Nationale pour la Recherche (bevilja ANR Specistem) för finansieringen av denna forskning.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| 기타 | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
