В пробирке методом наблюдать Е-селектин-опосредованных взаимодействий между простаты циркулирующих опухолевых клеток, взятых от пациентов и эндотелиальных клетках человека

Summary

Наш отчет описывает уникальный метод для визуализации и анализа взаимодействия КТК / EC в рака простаты в физиологических условиях потока.

Abstract

Метастазы это процесс, в котором опухолевые клетки пролить от первичной опухоли intravasate сосудистой крови и лимфатической системы, тем самым, получить доступ к вытекать из сосудов в ткань и образованием вторичного нишу. Экстравазации опухолевых клеток из кровеносной системы могут быть изучены с помощью эндотелиальных клеток (ECS) и опухолевых клеток, полученных из различных клеточных линий. Первоначальные исследования проводились с использованием статических условиях, но она была хорошо документирована, что ЭК-разному ведут себя в физиологических условиях потока. Таким образом, различные узлы проточной камеры в настоящее время используется для изучения раковых клеток взаимодействия с ЭК. Текущие сборки камеры поток предложить воспроизводимые результаты, используя как различные клеточные линии или жидкости на различных стрессовых условиях сдвига. Тем не менее, наблюдать и изучать взаимодействия с редких клеток, таких как циркулирующих опухолевых клеток (CTCs), определенные изменения должны быть внесены в обычной сборке проточной камеры. ЦОКявляются редким клеточной популяции среди миллионов клеток крови. Следовательно, трудно получить чистую популяцию ЦОК. Загрязнение ЦОК с различными типами клеток, обычно находящиеся в обращении неизбежно используя настоящий обогащение или методы истощения. В настоящем докладе мы описываем уникальный метод флуоресцентной метки циркулирующих раковых клеток простаты и изучать их взаимодействие с ЭК в самоорганизующихся системы камеры поток. Этот метод может быть применен в дальнейшем наблюдать взаимодействие между CTCs простаты и любого белка, представляющего интерес.

Introduction

Метастазы является сложным многоэтапным процессом, что еще малопонятным. E-selectin/selectin ось лиганд, как было показано, играют важную роль в метастазировании опухолей, способствуя первичных адгезивных взаимодействий между сосудистого эндотелия и раковых клеток ^1,2. Эндотелия (Е)-селектина представляет собой трансмембранный белок, экспрессируемый активированными эндотелиальными клетками, в то время как другая Е-селектина лиганд (ы) выражаются опухолевых клеток ^3. Подходы Многочисленные в пробирке были успешно использованы для моделирования E-selectin/selectin лиганд взаимодействия между опухолевыми клетками и эндотелиальных клеток (ECS) ^1. Для изучения этих взаимодействий, в настоящее время используется различные системы проточной камеры для имитации сосудистую систему крови. Среди камерных собраниях потока, поток камера плоского (PPFC) в сочетании с ЭК обычно используется в качестве модели в пробирке, имитирующей в естественных условиях стресса сдвига. В этомСпособ, ЭК выращивают на 35-мм чашку и после достижения монослой, ЭК прикреплены к PPFC и эксперименты напряжение сдвига на основе выполняются.

Тем не менее, PPFC и другие современные системы представить много ограничений к изучению адгезионные взаимодействия между циркулирующих опухолевых клеток (CTCs), полученные от пациентов и ECS, в первую очередь, потому, что ЦОК являются редким популяция клеток, сарай от первичной опухоли, циркулирующих среди миллионов клеток крови (1 СТС на 10 ⁹ клеток крови) ^4. Таким образом, в отличие от неограниченным запасом культивируемых клеточных линий, низкие показатели CTC привести к очень мало и редкие взаимодействия КТК / ЕС, требующие надлежащего ширину канала поток для записи взаимодействий для анализа воспроизведения. Кроме того, поскольку пациент, полученные ЦОК являются нечистыми населения, поэтому идентификация маркер требуется отслеживать CTCs в конкретных. Чтобы решить эту проблему, мы разработали новый метод для выявления рака предстательной железы (РПЖ) КТCs, воспользовавшись тем, что практически все эти CTCs выразить простатического специфического антиген мембраны (PSMA) на их клеточной поверхности ^5,6. В этом докладе мы использовали простаты линию раковых клеток, MDA PCa2b (MDA), чтобы продемонстрировать потенциальную полезность нашей новой системы для изучения простаты CTC взаимодействия с ЭК, в конце концов, чтобы понять механизм метастазирования.

Наша методология может применяться для различных экспериментов сдвига на основе моделирующих в системе естественных сосудистой ^7-9. Кроме изучения взаимодействия РПЖ СТС / ЕС, нынешняя система Проточная камера может быть легко адаптирована для анализа мононуклеарных клеток периферической крови или взаимодействия опухолевых клеток с ЭК. Легкость разборки и сборка проточной камеры, предметное стекло III ^(0.1) (далее как предметное стекло), позволяет культивирования ECs под перфузии и стимулирования ECs с различными цитокинами, чтобы побудить пр.otein выражение. Кроме того, культурный этике, рекомбинантные белки, такие как E-и P-селектина могут быть покрыты на предметное стекло и взаимодействия с опухолевыми клетками можно наблюдать в условиях ламинарного потока ^10.

Protocol

1. Культивирование HUVECs на Microslides для наблюдений СТС-эндотелиальных взаимодействий

1. Под капот культуры ткани, в первую промыть предметное стекло, ширину канала 1 мм с PBS. Осторожно пальто предметное стекло с 200 мкл 50 мкг / мл фибронектина (растворенного в PBS) с использованием 1-мл Luer-Lock шприц.
2. Накройте предметное стекло с крышкой и держать его внутри капот культуры ткани в течение 30 мин. Медленный дозирование жидкости в предметное стекло предотвращает образование пузырьков в канале.
3. Заливать 200 мкл теплой (37 ° C) HUVEC ростовой среде (М199 носители, 1М HEPES, 20% FBS, 5 мг / мл гепарина, 100 мкг / мл фактора роста эндотелия клеток и L-глутамина) на предметное стекло и инкубировать 20 мин при комнатной температуре. Во время перфузии, готовить суспензии клеток HUVEC.
4. Промыть HUVECs с PBS и добавляют 0,05% трипсин-ЭДТА в течение 1-2 мин при комнатной температуре. Центрифуга HUVECs в 2 мл среды роста при 180 х г в течение 5 мин.
5. Измерьте концентрацию клеток с использованием neubaUER гемоцитометр и подготовить 10 ⁷ HUVEC клеток/100 мкл ростовой среды. Затем осторожно удалить среды от входа в предметное стекло с помощью пипетки 200-мкл.
6. Принесите предметное стекло на уровень глаз и с помощью 1-мл Luer-Lock шприц, аккуратно заливать 200 мкл подготовленной концентрации HUVECs в канал. Осторожность необходима на этом этапе, чтобы предотвратить образование пузырьков. Если появляются пузырьки, держать перфузии для немного дольше, пока пузырьки не ввести выпускной канал.
7. Поместите равный объем (~ 80 мкл) HUVEC массовой информации в обоих входе и выходе на предметное стекло. Это предотвращает приток клеток в любом направлении.
8. Накройте слайд и держать его в инкубатор (37 ° C) в течение 1,5 часов.

2. Подготовка палаты Ассамблеи Flow для ночных HUVEC культуры на предметное стекло

1. Наведите стерильный 20 мл шприц, женские и мужские разъемы LUER, труб и шприцевой насос в инкубаторе в течение 15 мин.
2. Для минимальной мертвого объема, использовать трубку с внутренним диаметром 0,04 дюйма. Меньший диаметр трубы предотвращает образование пузырьков.
3. Заполните 20-мл шприц с теплой (37 ° C) HUVEC массовой информации (12 мл). Прикрепите трубку с разъемами на шприц. Удалите пузыри. Подключите эту сборку на предметное стекло.
4. Полностью заполните впуск предметное стекло с HUVEC СМИ. Принесите заполненную 20 мл шприц, прикрепленный к разъему рядом с предметное стекло. Аккуратно приложите разъем к предметное стекло.
5. Принесите настройку в инкубатор и подключите его к шприцевой насос, установленный в 10 скорости сдвига мкл / мин. Оставьте клетки O / N в инкубаторе при температуре 37 ° С.
6. На следующий день, разбирать настройку путем удаления соединитель, присоединенный к входному отверстию предметное стекло.
7. Чтобы активируют E-селектина на ЭК, готовят свежую среду роста, содержащую IL-1β в 10 нг / мл в 4 мл среды. Аспирируйте СМИ в 10-мл шприц. Удалить тон медиафайлы от входе в предметное стекло и подключить шприц к слайду.
8. Установите шприцевой насос на скорости сдвига 10 мкл / мин в течение 4 ч в инкубаторе.

3. Подготовка Anti-PSMA (J591-488) меченых клеток рака простаты

1. Во время Ил-1β инкубации HUVECs, подготовить анти-ПСМА J591-Alexa488 помечены РПЖ клетки. Добавить 0,05% трипсин-ЭДТА в MDA клеток в течение 1 мин. Не подвергать клетки к трипсином в течение более длительного времени, как это может влиять на гликопептиды, присутствующих на поверхности клеток. Фермент свободный диссоциации клеток реагент можно также использовать вместо трипсина. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
2. Ресуспендируют MDA осадок клеток в 1 мл H / H буфера (Хэнкс сбалансированный солевой solution/0.1% HSA/10 мМ HEPES / 1 мМ CaCl _2). Добавить анти-PSMA J591-Alexa488 антитело при 20 мкг / мл в течение 30 мин при комнатной температуре в темном месте. Ресуспендируют клеток при инкубации.
3. Через 30 мин, центрифугирование клеточной раствора при 800 х г в течение 5 мин. АспиСкорость и ресуспендируют осадок в 1 мл H / H буфера. Подсчет меченых клеток MDA и довести конечную концентрацию до 1х10 ⁶ клеток / мл. Заполните 5-мл шприц с J591-488 меченых клеток MDA и удалить пузырьки.

4. Подготовка Анти-ПСМА (J591-488) Маркированный ЦОК, обогащенном от РПЖ пациентов

1. Соберите 7,5 мл крови из больных раком простаты в синей кепке трубки (содержащей цитрат натрия). Осторожно развести 1:01 в крови в 0,1% BSA / 1 мМ ЭДТА / ФБР.
2. Добавить 5,3 мл Ficoll-Paque плюс в 50 мл коническую пробирку. Слой разбавленной крови в верхней части Ficoll-Paque. Центрифуга при 400 мкг в течение 30 мин.
3. Предварительное покрытие все трубки или наконечники вступления в контакт с ЦОК с 2% FBS/RPMI-1640 / 1 мМ CaCl _2/4 мМ MgCl ₂ (R / S буфера) для предотвращения неспецифического связывания из CTCs к поверхностям. Поддерживать 4 ° C температуру СМИ и буферов, которые соприкасаются с ЦОК.
4. Соберите мононуклеаров периферической крови клетки (МНПК) фракциисодержащий CTCs из интерфейса в другой 50-мл коническую трубку с 30 мл R / S буфер. Центрифуга при 400 мкг в течение 8 мин.
5. Ресуспендируют гранул и мыть раз в R / S буфера при 400 мкг в течение 8 мин. После центрифугирования ресуспендируют осадок в H / H буфере. Добавить анти-PSMA J591-488 антитело при 20 мкг / мл в течение 30 мин при комнатной температуре в темном месте.
6. Через 30 мин, центрифуги МНПК содержащие J591-488 меченых CTCs при 800 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют в H / H буфера. Заполните 1-мл шприц (предварительно покрытую R / S буфера) с образцом.

5. Подготовка микроскопа, шприцевой насос и камерной Ассамблея потока

1. Включите инвертированного микроскопа и установить освещение Kohler на 10X цели. Доведите шприцевой насос на том же уровне, на стадии выборки микроскопа и установить его в 1 дин / см ² напряжения сдвига (~ 10 мкл / мин).
2. Откройте программу Zeiss AxioVision. Выберите цель на экране компьютера. Создать новуюпапку в опции инструментов в программном обеспечении.
3. Откройте опцию умные эксперименты в AxioVision и изменить настройки для записи коротких 30 секунд видео в течение 30 мин.
4. Для живого флуоресцентного видео, установить опции-12 изображений мс экспозиции, 2 х 2 Bin, 5 Gain. Эти параметры помогут в достижении видео, близкие к частоты кадров (~ 23 кадров в секунду) с камерой Zeiss MRM.
5. Для визуализации всю ширину канала для потока в 10 X цели на экране компьютера, использовать адаптер C-Mount (0,63 интерфейса xf/60 мм).
6. Включите ртутной лампы.
7. Поместите шприц и разъем, содержащий клетки на шприцевого насоса.
8. Принесите IL-1β стимулировали HUVECs из инкубатора. Подключите разъем к заполненной впускного канала предметное стекло, содержащей HUVECs.
9. Подключите выходной канал с разъемом, прикрепленной к трубке. Положите трубку в блюдо или 15 мл коническую трубку, чтобы собрать поток через.
10. Запустите infusiна сквозь предметное стекло при 10 мкл / мин. Соблюдайте взаимодействия между эндотелиальных клеток и меченых клеток MDA или меченых ЦОК, полученных от пациентов в 488 нм фильтра на эпифлуоресцентной микроскопом.
11. Начало записи эксперимент как 30 сек коротких видеороликов. Во время воспроизведения анализа, измерения скорости качения. Прокатный скорость измеряется путем деления расстояния, пройденного клеток с течением времени.

6. Иммуноокрашивание на предметное стекло

1. Извлеките носитель из входе и выходе в предметное стекло после перфузии MDA клеток на IL-1β-стимулированных HUVECs в течение 10 мин.
2. Использование 200-мкл наконечник, положить теплую (37 ° С) PBS, содержащий кальций и магний в входе предметное стекло в течение 5 мин. Наклоните предметное стекло, используя его крышку как опору на скамейке. Держите предметное стекло в наклонном положении для всех инкубации в течение иммунной окраски.
3. Fix HUVECs путем перфузии теплый 2% формальдегида во входное отверстие
4. Добавить Тритон-X 100 (0,1%) в 5% BSA в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
5. Промыть два раза с PBS в течение 5 мин каждый. Блок с 5% БСА в PBS в течение 30 мин.
6. Инкубировать с первичным антителом козы против VE-кадгерин (1:100) в 2,5% BSA O / N при 4 ° С.
7. На следующий день, мыть дважды PBS в течение 5 мин каждый. Добавить вторичный осла анти-козел 647 антитела в течение 45 мин. Мыть два раза с PBS в течение 5 мин каждый.
8. Инкубируют при комнатной температуре с гуманизированного J591-Alexa488 конъюгированных антител в течение 1 часа.
9. Мыть два раза с PBS в течение 5 мин каждый. Добавить DAPI в течение 5 мин. Промыть дистиллированной воде в течение 5 мин.
10. Добавить PBS (или Mowiol для долговременного хранения). Визуализируйте предметное стекло под конфокальной микроскопии.

Representative Results

На рисунке 1 показан O / N культуру монослоя ЭК на предметное стекло. В окалина на рисунке 1а показывает, что 100% от предметное стекло видна помощью 5X цели в то время как 70% видна с использованием объектива 10X (рис. 1В). Для E-селектина опосредованного взаимодействия, клетки прокат по краям не считаются, который составляет более 70% от предметное стекло для видео-записи и анализа воспроизведения. По нашему опыту, изначально эта установка сборки необходим практику культуры монослоя ЭК под напряжением сдвига. После установления рост ЕС на предметное стекло, мы пометили MDA, клетки рака простаты. Специфика J591-488 анти-PSMA антител была проверена с помощью MDA клетки шипами в здоровой донорской крови и меченные флуоресцентно меченных анти-ПСМА J591-488 моноклональное антитело. Нет PSMA иммунное окрашивание не наблюдалось в РВМС (данные не показаны). Чтобы исключить возможность того, что обязательный J591-488 и интернализация AlteRS прокатки поведение, мы помечены MDA клетки с J591-488 и по сравнению качению поведение с немеченых MDA клеток при касательных напряжений в пределах от 1-10 дин / см ^2. Коробка график показывает распределение скоростей прокатки обеих немеченого и J591-488-меченых клеток MDA на IL-1β-стимулированных ЭК при различных условиях стресса сдвига. Никаких существенных различий не наблюдалось скоростей прокатки на 1 и 5 дин / см ^2, р = 0,634 и р = 0,601, соответственно (рис. 2). При более высоком напряжении сдвига 10 дин / см ^2, статистически значимая разница наблюдалась между прокатки скоростей немеченого и J591-488-меченых клеток MDA (р <0,05). Предыдущие исследования показали, что при более высокой напряжения сдвига (> 3 дин / см ²⁾ условия, меньше опухолевых клеток придерживаться-н-ролл на ЭК по сравнению с более низкими сдвига условиях стресса ^11,12. Таким образом, исследования, анализирующие взаимодействие между опухолевыми клетками и ЭК проводятся при более низких напряжениях сдвига. Чтнам, наши данные показывают, что ЦОК могут быть помечены J591-488 и что флуоресцентного мечения CTCs существенно не влияет на качению поведение на широком диапазоне напряжения сдвига. Следует отметить, что мы не обнаружили каких-либо взаимодействий СТС / ЕС в отсутствие IL-1β стимуляции ECS (данные не представлены). Кроме того, в качестве доказательства принципе, мы также помечены обогащенные CTCs выделенные из CRPc пациентов с J591-488 и перфузированных над IL-1β-стимулированных ЭК. Время сшитые видео показывает различные типы взаимодействий между простаты ЦОК и ECS (Видео 1). Видео показывает три типа взаимодействий-стабильные адгезии (ЦОК не оторвать даже после 30 сек), модем (ЦОК приложить и прикрепить), и никаких взаимодействий. Microslides можно легко иммуноокрашиванию и флуоресцентные изображения могут быть приняты, потому что microslides имеют схожие оптические характеристики, 1,5-мм толщиной покровного стекла ^7. Рисунок 3 показывает твердую адгезию J591-488 меченых MDA клеток кормеэ перфузии над IL-1β-стимулированных ЭК.

Рисунок 1:. Монослой эндотелиальных клеток, культивируемых на предметное стекло HUVECs культивировали O / N на фибронектина (50 мкг / мл) с покрытием предметное стекло III ^(0.1) при напряжении сдвига (1 дин / см ²⁾ а) по меньшей 5X цели. (План ЕС Neofluar 5X/0.16), наблюдалось полное ширина канала для потока с культурной ЭК. Ширина канала измерялась быть 1,545.95 мкм. Б) В 10X цели (План Neofluar 10X/0.3 Ph1), наблюдалось 1,065.79 мкм канала. Это говорит о том, что ЭК можно культивировать O / N на предметное стекло и 70% от предметное стекло виден 10-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше веrsion этой фигуры.

Рисунок 2. Роллинг скорость MDA клеток на ЭК культивировали на предметное стекло. Один миллион немаркированные и J591-488 меченые клетки MDA перфузировались над IL-1β-стимулированных HUVECs. Десять видео в различных областях на предметное стекло были записаны в 1,5, и 10 дин / см ^2. Поперечные расчет напряжений были предоставлены производителем. Была выполнена в сети анализ для скорости качения. п = количество подсчитанных клеток для измерения скорость качения. Коробка график показывает распределение качения скоростей и срединных различий между J591-488 меченых и без таковой клеток MDA. р <0,05, Вилкоксона ранговой суммы. Круги представляют выбросы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы VIEW большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Иммуноокрашивание MDA клеток, взаимодействующих с ЭК на предметное стекло. Один миллион MDA клетки перфузии над Ил-1β-стимулированных HUVECs на 1 дин / см ² напряжения сдвига. После перфузии, иммуноокрашивание проводили на предметное стекло. Желтые стрелки показывают MDA клетки прочно прилипших к ЭК. ПСМА = красный, VE-Cadherin = зеленый, DAPI = синий. Объединенная изображение показывает все цвета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Видео 1. Ролик, демонстрирующий взаимодействие между ИЛ-1β-стимулированных HUVECs и анти-PSMA J591-488-меченых CTCs обогащенных от больного раком простаты. Монослой ое HUVECs культивировали на предметное стекло III ^(0.1) и анти-PSMA J591-488-меченых мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), содержащего CTCs обогащенный от пациента перфузировали на HUVECs на 1 дин / см ^2. Во время перфузии, короткие 30 сек видео были записаны, в различных областях на предметное стекло. Время приобретение видео показано на нижнем левом углу. Различные короткие видео были сшиты вместе, чтобы составить этот видео. В 2:16:36, невзаимодействующих СТС входит в верхний левый угол обзора; в 2:19:16, другой невзаимодействующих СТС входит в левый угол поля зрения; в 2:23:12, стабильно придерживались СТС в верхнем среднем поле зрения видно. В 2:38:09, стабильно придерживались CTC видно на правой стороне поля зрения виден. Это видео было принято с использованием как светлого поля и флуоресцентный канал, чтобы показать взаимодействие МНПК также. В 2:40:18, стабильно придерживались ЦОК наблюдались в середине верхней поле зрения. Это видео был сделан с использованием светлого поляи люминесцентные канал, чтобы показать качению поведение в МНПК. С 2:51:39 через 2:51:49, выставляется поведение модема СТС наблюдалось в нижнем поле зрения. Нажмите здесь для просмотра ролика.

Discussion

Из-за малого количества циркулирующих опухолевых клеток среди клеток крови, трудно изолировать CTCs в виде чистого популяции клеток. С целью изучения взаимодействия КТК / EC, редких и нечистое население ЦОК представляет две основные задачи: а) выявление CTCs среди клеток крови; б) Наблюдение взаимодействия КТК / EC.

Для ликвидации первой ограничение выявление CTCs простаты среди клеток крови, мы воспользовались тем, что практически все простаты опухолевые клетки выразить ПСМА ^6. Моноклональное антитело J591-488 интернализуется следующие клеточной поверхности связывания предполагая, что РПЖ ЦОК могут быть помечены экс естественных и учился взаимодействий СТС / EC ^13. Для оптимальной интернализации антитела и максимальной иммунофлуоресценции мы инкубировали клетки MDA с антителом на любом 4 ° С или 37 ° С в течение либо 30 мин или 1 часа. Мы заметили, что максимальный иммунофлюоресценции наблюдалась при37 ° C в течение 30 мин (данные не показаны) и иммунофлуоресцентного мечения клеток предстательной железы не влияет на поведение качению по сравнению с немеченого клеток предстательной железы.

Для преодоления ограничений по вторичному, мы протестировали различные камерные поток сборок, таких как PPFC, Bioflux системы микрофлюидики и Microslides ^7. PPFC стал оплотом для изучения лейкоцитов и опухолевых клеток взаимодействия с ЭК в физиологических условиях потока ^9. Эта система хорошо работает поток изучить взаимодействие большого количества клеток, таких как линий раковых клеток, но не идеально, чтобы наблюдать и изучать взаимодействие между редких элементов, таких как пациентов, полученных ЦОК и ECS. CTCs, будучи редкие клетки, могут взаимодействовать с ЭК случайным образом в любом месте в канале потока, таким образом, запись полной ширины канала потока требуется, чтобы наблюдать и анализировать редкие взаимодействия между событий ЦОК / ЭК при анализе воспроизведения. Чте ширина силиконовой прокладкой, используемой в PPFC (2,5 мм) не обеспечивает полное поле зрения при 10-кратном цели. В то время как, по более низкой увеличении чем 10X цели, становится трудно четко наблюдать взаимодействия КТК / EC. Кроме того, низкий мертвый объем в соединительных труб необходимо, чтобы избежать захват ЦОК в соединительных трубок. В Silastic соединительные трубки, снабженные стандартной PPFC имеют широкий внутренний диаметр (0,16 дюйма). Напротив, Bioflux система обеспечивает полный микрофлюидики поле зрения при 20X цели и полезен при изучении изменения сдвига, вызванных в ЭК ^14, однако, раковые клетки начинают осесть в камере скважин, ведущих к неравномерной потока. Bioflux микрофлюидики полезно при изучении изменения сдвига, вызванных в ЭК, однако, это технически громоздким для использования. Наша самоорганизующихся камера потока с использованием предметное стекло имеет узкую ширину канала (1 мм), чем стандартный ширины канала в PPFC, позволяя больше наблюденийных площадь. Кроме того, по этике культивируют в перфузии в предметное стекло имитации физиологического кровотока, в отличие от Гангули и др.. ^7, исследования, где ЭК выращиваются на microslides (с широкой ширины канала) в статических условиях. Мертвый объем внутри соединительных трубок уменьшается с помощью соединительной трубки с внутренним диаметром 0,02 дюйма коллективно иммунофлуоресцентным маркировки клеток опухоли простаты, правильной ширины канала потока, и меньшим внутренним диаметром соединительных труб позволяет идентифицировать CTCs простаты и наблюдать их взаимодействие с ЭК.

Есть несколько важных шагов в протоколе, однако, при надлежащем уходе эксперименты могут работать бесперебойно. Профилактика пузырьков имеет решающее значение для любых экспериментов на основе потоков. По нашему опыту, используя тепло (37 ° С) питательную среду, разъемы, и шприц предотвращает образование пузырьков за счет уменьшения разницы температур. В Additioп, следует позаботиться при подключении шприц с предметное стекло. Оба соединитель прикреплен к шприцу и входе в предметное стекло должно быть заполнено до краев, тем самым, предотвращая любое образование пузырьков. Одним из ограничений метода является то, что поскольку предметное стекло канал 45 х 1 мм (длина х ширина), он может только держать 4,5 мкл среды роста. Таким образом, предметное стекло не может быть использована для статического культуры и требует непрерывной перфузии ростовой среде, чтобы предотвратить окисление и поддержания надлежащего питательных веществ для HUVECs. Тем не менее, непрерывная подача среды могут быть легко достигнуты с помощью шприцевого насоса, подключенного к предметное стекло в инкубаторе. В то время как обогащение CTCs от пациентов с раком простаты, следует позаботиться заранее пальто все трубы, советы, пипетки, и шприцы, которые соприкасаются с ЦОК с R / S буфера для предотвращения неспецифического связывания. Кроме того, все шаги после Ficoll-Paque плотность центрифугирование, еxcept J591-488 антитело инкубации следует проводить при 4 ° С, чтобы предотвратить деградацию ЦОК.

Наша методика уникальна по сравнению с различными методами понимание СТС биологию. В настоящем докладе описываются жизнеспособной флуоресцентного иммунного из ЦОК простаты, который позволяет наблюдать функциональные характеристики CTCs простаты, помимо всего фенотипических свойств. Кроме того, описанный способ требует малый объем выборки / реагента, чем другие методы делает его идеальной системой для иммунофлюоресценции исследований. Наша методология обеспечивает уникальную платформу для изучения взаимодействия между CTCs простаты, полученных от пациентов и ЭК, таким образом, помогая понять механизмы, участвующие в развитии метастазов рака простаты. Этот метод имеет потенциал для нескольких приложений, связанных сдвига потока на основе исследования, такие как межклеточных взаимодействий ^8, клеточно-белковых взаимодействий ¹⁵ 16, а также изменения сдвига, вызванных в ЭК ^14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02