Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting
Summary
Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.
Abstract
Bottom-up synthetische biologie biedt een nieuwe benadering voor het onderzoeken en reconstitueren biochemische systemen en mogelijk minimale organismen. Dit nieuwe terrein bezig ingenieurs, chemici, biologen en natuurkundigen te ontwerpen en assembleren fundamentele biologische componenten in complexe, goed functionerende systemen van beneden naar boven. Dergelijke bottom-up systemen kan leiden tot de ontwikkeling van kunstmatige cellen voor fundamenteel biologisch onderzoek en innovatieve therapieën 1,2. Giant unilamellaire blaasjes (GUVs) kan dienen als model platform voor synthetische biologie vanwege hun cel-achtige membraan structuur en omvang. Microfluïdische jetting of microjetting, is een techniek die het mogelijk maakt voor het genereren van GUVs met gecontroleerde grootte, membraansamenstelling, transmembraan eiwit incorporatie en inkapseling 3. Het basisprincipe van deze werkwijze is het gebruik van meerdere, hoogfrequente fluïdum pulsen gegenereerd door een piëzo-inkjet-inrichting een gesuspendeerde l vervormenIPID dubbellaag in een GUV. Het proces is te vergelijken met het blazen zeepbellen uit een soap film. Door het variëren van de samenstelling van de gespoten oplossing, de samenstelling van de oplossing omvat, en / of de componenten van de bilaag, kunnen onderzoekers deze techniek toegepast om aangepaste blaasjes maken. Dit document beschrijft de procedure voor eenvoudige blaasjes genereren uit een druppel-interface dubbellaag door microjetting.
Introduction
Het is steeds duidelijker geworden dat de celbiologie is een multi-schaal probleem dat impliceert het integreren van ons begrip van moleculen tot cellen. Bijgevolg weten precies hoe moleculen werken individueel is niet voldoende om complexe cellulaire gedrag te begrijpen. Dit is deels te wijten aan het bestaan van de inzichten in het gedrag van multi-component systemen, zoals wordt geïllustreerd door de reconstructie van actine netwerk interactie met lipidedubbellaag blaasjes 4, mitotische spoel assemblage in Xenopus extraheren 5 en ruimtelijke dynamiek van bacteriële celdeling machines 6. Een manier om de reductionistische de aanpak van het ontleden van de moleculaire processen van levende systemen een aanvulling is op de tegenovergestelde benadering voor de reconstructie van cellulaire gedrag met behulp van een minimale set van biologische componenten te nemen. Een belangrijk onderdeel van deze benadering betrouwbare inkapseling van biomoleculen in een afgesloten volume, een belangrijk kenmerk van een cel.
e_content "> Verschillende strategieën bestaan voor het inkapselen van biomoleculen te bestuderen biomimetic systemen. De meest biologisch relevante systeem is lipidedubbellaag membranen, die de biochemische en fysische beperkingen opgelegd door de cel plasmamembraan Vorming van reusachtige unilamellaire blaasjes (GUVs) door electroformation 7 na te bootsen., een van de meest gebruikte technieken GUV generatie 14, typisch een slechte inkapseling opbrengst vanwege de onverenigbaarheid met hoge zout buffer 8. Electroformation vereist ook grote monstervolumes (> 100 ui), die een probleem zijn voor het werken met gezuiverde eiwitten en inefficiënt bevat grote moleculen wegens moeilijkheid diffusie tussen dicht bij elkaar gelegen lipide lagen. microfluïdische verschillende benaderingen voor het genereren van lipide vesicles ontwikkeld. De dubbele emulsie methoden die componenten passeren twee grensvlakken tussen lagen water-olie-water (W / O / W), gebaseerd op de verdamping van een volatile oplosmiddel lipide bilaag vorming 9 rijden. Anderen hebben een microfluïdisch assemblagelijn dat een continue stroom van lipidendubbellaag blaasjes 10 of in twee onafhankelijke stappen 11 produceert gebruikt. We hebben een alternatieve techniek die gebaseerd is op snel toepassen van vloeistof pulsen tegen een druppel-interface bilayer 12 tot GUVs van gecontroleerde omvang, samenstelling, en inkapseling produceren. Onze benadering, bekend als microfluïdische jetting, biedt de gecombineerde voordelen van verscheidene bestaande blaasje generatie technieken verschaffen een aanpak voor het maken van functionele biomoleculaire systemen voor het onderzoeken van verschillende biologische problemen.Protocol
Representative Results
Discussion
Veel technieken zijn ontwikkeld voor vesicle generatie, zoals electroformation, emulsie en druppel generatie 14-16. Echter, nieuwe experimentele technieken nodig dat voor het ontwerp van biologische systemen met toenemende gelijkenis met levende systemen. Microfluidic methoden in het bijzonder, hebben een verhoogd niveau van controle inzake membraan unilamellarity, monodispersity van grootte, en de interne inhoud 17,18 aangeboden, waardoor blaasje modellen dichter bij biologie. Bovendien, karakteri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Mike Vahey van de Fletcher Lab aan de Universiteit van Californië, Berkeley voor advies over de microjetting parameters. Dit werk werd gesponsord door de NIH-subsidie DP2 HL117748-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
- Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
- Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
- Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
- Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
- Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
- Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
- Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
- Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).
