Lipid Bilayer Vesicle Geração Usando Microfluidic jateamento
Summary
Jorrando Microfluidic contra uma bicamada lipídica interface de gota fornece uma maneira confiável para gerar vesículas com controle sobre a assimetria da membrana, a incorporação de proteínas transmembrana, e encapsulamento do material. Esta técnica pode ser aplicada ao estudo de uma grande variedade de sistemas biológicos, onde são desejados biomoléculas compartimentadas.
Abstract
Biologia sintética Bottom-up apresenta uma nova abordagem para investigar e reconstituir sistemas bioquímicos e, potencialmente, organismos mínimos. Este campo emergente envolve engenheiros, químicos, biólogos e físicos para projetar e montar componentes biológicos básicos em funcionamento de sistemas complexos, a partir de baixo para cima. Tais sistemas bottom-up pode levar ao desenvolvimento de células artificiais para investigações biológicas fundamentais e terapias inovadoras 1,2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs) pode servir como um modelo para a plataforma de biologia sintética, devido à sua estrutura da membrana celular-como e tamanho. Jacto de microfluidos, ou microjetting, é uma técnica que permite a geração de GUVs com tamanho controlado, a composição da membrana, a incorporação da proteína transmembranar, e encapsulação 3. O princípio de base deste método é o uso de vários impulsos de fluido, de alta-frequência gerados por um dispositivo de jacto de tinta piezo-actuada para deformar uma l suspensobicamada IPID num GUV. O processo é semelhante ao soprar bolhas de sabão a partir de uma película de sabão. Através da variação da composição da solução de hidromassagem, a composição da solução que engloba, e / ou os componentes incluídos na camada dupla, os investigadores podem aplicar esta técnica para criar vesículas personalizadas. Este artigo descreve o procedimento para gerar vesículas simples a partir de uma bicamada interface de gota por microjetting.
Introduction
Tornou-se cada vez mais claro que a biologia celular é um problema multi-escala que envolve a integração de nossa compreensão a partir de moléculas às células. Consequentemente, sabendo exatamente como as moléculas trabalhar individualmente não é suficiente para compreender os comportamentos celulares complexos. Isto é em parte devido à existência de comportamentos emergentes de sistemas multi-componentes, como exemplificado pela reconstituição de interação da rede de actina com vesículas bicamada lipídica 4, montagem do fuso mitótico em Xenopus extrair 5 e dinâmica espacial de bactérias máquinas divisão celular 6. Uma maneira de complementar a abordagem do reducionista de dissecar os processos moleculares dos sistemas vivos é tomar o caminho inverso de reconstituir comportamentos celulares usando um conjunto mínimo de componentes biológicos. Uma parte crítica dessa abordagem envolve o encapsulamento confiável de biomoléculas em um volume confinado, uma característica fundamental de uma célula.
e_content "> Várias estratégias existentes para o encapsulamento de biomoléculas para estudar sistemas biomiméticos. O sistema mais biologicamente relevante é membranas de bicamadas de lípidos, que imitam os constrangimentos físicos e bioquímicos impostas pela membrana plasmática da célula. Formação de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) por eletropolimerização 7, uma das técnicas mais amplamente utilizadas para a geração de GUV 14, tem, tipicamente, uma baixa eficiência de encapsulação devido à sua incompatibilidade com tampão de alto teor salino 8. eletropolimerização também requer grandes volumes de amostra (> 100 mL), o qual pode ser um problema para o trabalho com proteínas purificadas , e de forma ineficiente incorpora moléculas grandes, devido à dificuldade de difusão entre as camadas lipídicas espaçados. Várias abordagens de microfluidos para gerar vesículas lipídicas foram desenvolvidos. Os métodos de emulsão dupla, que passam através de duas componentes de interfaces entre as camadas de água-óleo-água (W / O / W), baseia-se na evaporação de um volatile solvente para conduzir a formação de bicamada lipídica 9. Outros utilizaram uma linha de montagem de microfluidos, que produz um fluxo contínuo de vesículas lipídicas de duas camadas 10 ou em duas etapas independentes de 11. Desenvolvemos uma técnica alternativa baseada em rápida aplicação de impulsos de fluido de encontro a uma bicamada de interface gota 12 para produzir GUVs de tamanho controlado, composição, e de encapsulamento. A nossa abordagem, conhecida como jacto de microfluidos, oferece as vantagens combinadas de várias técnicas de geração de vesículas existentes, proporcionando uma abordagem para a criação de sistemas de biomoléculas funcionais para investigar uma variedade de problemas biológicos.Protocol
Representative Results
Discussion
Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de vesículas, incluindo eletropolimerização, emulsão, e de geração de gotículas 14-16. No entanto, novas técnicas experimentais são necessários para permitir a concepção de sistemas biológicos com a crescente semelhança com os sistemas vivos. Métodos microfluídicos em particular, têm oferecido um aumento do nível de controle que regem unilamellarity membrana, monodispersity de tamanho e conteúdo interno 17,18, trazendo mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mike Vahey do Lab Fletcher, da Universidade da Califórnia, em Berkeley para aconselhamento sobre os parâmetros microjetting. Este trabalho foi patrocinado pelo NIH conceder DP2 HL117748-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
References
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