Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting
Summary
Mikrofluidik-Strahl gegen eine Tröpfchen Schnittstelle Lipid-Doppelschicht bietet eine zuverlässige Möglichkeit, die Kontrolle über Vesikel mit Membran-Asymmetrie, die Aufnahme von Transmembranproteinen und Kapselung von Material zu erzeugen. Diese Technik kann angewandt werden, um eine Vielzahl von biologischen Systemen, in denen unterteilte Biomolekülen gewünscht studieren.
Abstract
Bottom-up-synthetische Biologie stellt einen neuartigen Ansatz für die Untersuchung und Wiederherstellung biochemischen Systemen und möglicherweise Minimalorganismen. Dieses neue Gebiet engagiert Ingenieure, Chemiker, Biologen, Physiker und in komplexe, funktionierende Systeme von Grund auf zu entwerfen und montieren biologische Grundkomponenten. Solche Bottom-up-Systeme könnten für die Entwicklung der künstlichen Zellen, die für die biologische Grundlagen Anfragen und innovative Therapien 1,2 führen. Riesen einschichtige Vesikel (GUV) als Modellplattform für die synthetische Biologie aufgrund ihrer zellähnlichen Membranstruktur und Größe zu dienen. Mikrofluidausstoß oder microjetting, ist eine Technik, die für die Erzeugung von GUVs mit kontrollierter Größe, die Zusammensetzung der Membran, Membranprotein Einbau und Kapselung 3 ermöglicht. Das Grundprinzip dieses Verfahrens ist die Verwendung von mehreren Hochfrequenz-Fluidimpulse von einem piezobetätigten Tintenstrahlvorrichtung, um einen suspendierten l verformen erzeugtenIPID Doppelschicht in eine GUV. Das Verfahren ist vergleichbar mit Seifenblasen aus einem Seifenfilm. Durch Variation der Zusammensetzung der ausgestoßenen Lösung, die Zusammensetzung der Lösung, umfasst, und / oder der Komponenten in der Doppelschicht enthalten ist, können die Forscher, diese Technik anzuwenden, um maßgeschneiderte Vesikel zu erzeugen. Dieses Papier beschreibt das Verfahren, um einfache Vesikel aus einer Doppelschicht von Tröpfchen-Schnittstelle microjetting generieren.
Introduction
Es wurde zunehmend klar, dass der Zellbiologie ist ein Multi-Problem, das die Integration unserer Verständnis von Molekülen, Zellen beinhaltet. Folglich genau zu wissen, wie Moleküle arbeiten einzeln nicht ausreicht, um komplexe zelluläre Verhaltensweisen zu verstehen. Dies ist teilweise auf das Vorhandensein von aufkommenden Verhaltens von Mehrkomponentensystemen, wie durch das Auflösen von Aktin-Netzwerk Interaktion mit Lipiddoppelschicht-Vesikel 4, mitotischen Spindelanordnung in Xenopus Beispiel 5 extrahieren und die räumliche Dynamik der bakteriellen Zellteilung Maschinen 6. Ein Weg, der reduktionistischen Ansatz zu sezieren die molekularen Prozesse lebender Systeme ergänzen ist, den umgekehrten Weg der Wiederherstellung zellulären Verhaltensweisen mit einem minimalen Satz von biologischen Komponenten zu nehmen. Ein wichtiger Teil dieses Ansatzes umfasst die zuverlässige Verkapselung von Biomolekülen in einem begrenzten Volumen, eine wichtige Funktion einer Zelle.
e_content "> Mehrere Strategien gibt es zur Verkapselung von Biomolekülen für die Untersuchung biomimetischer Systeme. Die meisten biologisch relevanten System Lipidmembranen, die die biochemischen und physikalischen Beschränkungen, die durch Plasmamembran der Zelle auferlegt imitieren. Bildung von Riesen einschichtige Vesikel (GUV), die durch Galvanoformation 7, eine der am häufigsten verwendeten Techniken zum GUV Generation 14 weist typischerweise eine schlechte Ausbeute Verkapselung aufgrund seiner Unverträglichkeit mit Hochsalzpuffer 8. Galvanoformation erfordert auch große Probenvolumina (> 100 &mgr; l), was ein Problem für die Arbeit mit gereinigten Proteinen könnte und ineffizient enthält große Moleküle aufgrund der Diffusion zwischen eng beieinander liegenden Lipidschichten. Mehrere mikrofluidischen Ansätze zur Erzeugung von Lipidbläschen entwickelt worden. Die Doppelemulsionsverfahren, die Komponenten über zwei Schnittstellen zwischen den Schichten Wasser-Öl-Wasser zu lassen (W / O / W), beruht auf der Verdampfung eines volatile Lösungsmittel zur Bildung Lipid-Doppelschicht 9 zu fahren. Andere haben eine mikrofluidische Montagelinie, die einen kontinuierlichen Strom von Lipid-Doppelschicht-Vesikel 10 oder in zwei unabhängigen Schritten 11 erzeugt eingesetzt. Wir haben eine alternative Technik, die auf die Anwendung schnell Fluidpulse gegen eine Tröpfchen Schnittstelle Doppelschicht 12 bis GUVs kontrollierter Größe, Zusammensetzung und Kapselung produzieren. Unser Ansatz, wie mikrofluidischen Strahl bekannt ist, bietet die kombinierten Vorteile von mehreren vorhandenen Vesikel-Generation-Techniken und bietet einen Ansatz für die Erstellung von funktionalen Biomolekülen zur Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Problemen.Protocol
Representative Results
Discussion
Viele Techniken zur Bläschenerzeugung entwickelt worden, einschließlich Galvanoformation, Emulsions-und Tröpfchenerzeugung 14-16. Jedoch sind neue experimentelle Techniken notwendig, um für das Design von biologischen Systemen mit wachsender Ähnlichkeit mit lebenden Systemen zu ermöglichen. Mikrofluidik-Verfahren haben sich insbesondere ein erhöhtes Maß an Kontrolle über Membran unilamellarity, Monodispersität der Größe und interne Inhalte 17,18 angeboten, womit Vesikel Modelle näher a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mike Vahey von der Fletcher Lab an der University of California, Berkeley, für Beratung zu den microjetting Parameter. Diese Arbeit wurde vom NIH HL117748 DP2-01 gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
References
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