プロデュース上皮損傷の解析<em>赤痢アメーバ</em>感染症
Summary
赤痢アメーバによるヒト感染はアメーバ、熱帯の国では下痢の主な原因につながる。感染は、細胞 – 細胞接触の開口部と、その結果、下痢、時には肝臓感染症が続くを刺激、腸上皮細胞による病原体の相互作用によって開始される。この記事では、アメーバ症の病因の理解を向上させるために初期の宿主 – 病原体相互作用を評価するためのモデルを提供します。
Abstract
赤痢アメーバは、人間のアメーバ症の原因物質、下痢や熱帯諸国における肝膿瘍の主要な原因である。感染は、腸上皮細胞と病原体との相互作用によって開始される。この相互作用は、このようなタイトジャンクション（TJ）のような細胞間構造の破壊につながる。 TJは、腸管内腔から宿主組織を分離する上皮層のシール性を確保。最近の研究では、寄生タンパク質EhCPADH112によるTJの破壊がEのための前提条件であるという証拠を提供上皮バリア機能障害を伴うアメーバ侵入 。このように、E.中にTJ分解に関与する分子メカニズムの解析アメーバの侵入はアメーバ症の病因の理解を向上させるために最も重要である。この記事では、最初の宿主 – 病原体相互作用の評価と寄生虫の侵入の可能性を可能にする簡単なモデルを提示。分析対象となるパラメータは、Tが含まれransepithelial電気抵抗、上皮表面受容体発現の変化および上皮接合マーカーおよび上皮細胞内寄生生物分子の局在化の局在化との相互作用EhCPADH112。
Introduction
赤痢アメーバは、人間のアメーバ、炎症や下痢を引き起こす腸の感染症の責任ある単細胞の原生動物である。E.アメーバは毎年5000万個人にまで感染するが、感染者の約10％がアメーバ1に関連した症状を起こす。感染はEを含む汚染された食物や水の摂取時に起こるアメーバ嚢胞 。腸内で、嚢胞は、大腸ムチンに付着し、2を増殖するライブ栄養型を生産する。栄養型は通常、便を経由して排泄される嚢胞を形成している。他のケースではまだ未知の理由のために、栄養型は腸管上皮層を破壊し、下層組織に侵入する。最悪のケースでは、それらは血流に入り、肝臓3など他の臓器に影響を与える。
上皮バリアを破ることは入社細胞を維持する上皮性膜貫通構造の破壊を必要とします。上皮細胞連絡先はタイト（TJ）からなる頂端接合部複合体により形成され、接合（AJ）を接着結合、および4をデスモソームている。ほとんどの頂端接合部は、TJであるため、彼らはEで侮辱し第一関門であるホスト侵入中にアメーバといくつかの他の病原体。 TJは、隣接セルの受容体とホモまたは異種相互作用に関与クローディン、オクルディンおよび接合部接着分子（JAM）のような膜貫通接着受容体で構成されている。それらは、細胞内で上皮にさらなる機械的強度を提供するために、アクチン細胞骨格に接着レセプターを接続する閉鎖帯（ZO）ファミリーの足場分子によって結合される。 TJは、過剰な水および溶質の漏れを防止する、腸管内腔から腸組織をシールするための責任がある。 TJは、寄生虫によって破壊された後にこのように、組織を侵略している。E. （I）TARGにアメーバの接着に関与するもの： アメーバのようないくつかの分子を分泌するらセル5; （ii）は、例えば、エキソサイトーシスによって宿主細胞の殺傷に関与する膜活性因子、6,7 amoebaporesと呼ばれるイオンチャネル形成ペプチドを;および（iii）細胞外マトリックスタンパク質を分解し、組織崩壊を媒介5,8,9プロテイナーゼ。
一緒にEhCPADH112複合体を形成するシステインプロテアーゼEhCP112及び接着分子EhADH112は、2つのE.あるTJ 10の分解に大きな役割を果たしているアメーバの病原性タンパク質。ライブ栄養型、それらの総溶解物および分泌された製品は、上皮バリアのTJ複雑で機能障害の分子の変化を誘導する。本研究では、EhCP112とEhADH112は、このようにEを容易に細胞タンパク質の内在化と分解をもたらすオクルディンとクローディン1タンパク質と相互作用することが示されている傍細胞経路を介したアメーバの入り口。
我々のデータは、これらのOF他のグループ11から17を強く寄生虫の侵入を可能にする特定宿主-病原体相互作用の必要性を示唆している。これらの相互作用の分子基盤を解明することはアメーバ症の病因のより良い理解のために最も重要である。傍細胞透過性の増大によって特徴付け栄養によるTJの選択的な外乱が、経上皮電気抵抗（TER）の減少によって測定することができる。宿主上皮に向かって寄生タンパク質の移動は、免疫蛍光染色および共焦点レーザー顕微鏡法も可能での直接的な相互作用を示す上皮接合部のマーカーとアメーバの病原性因子の共局在を明らかにすることができる方法によって決定することができる。この記事では、上皮細胞と栄養が、栽培収穫し、宿主 – 病原体相互作用とその結果を検討するために操作する方法を詳細に説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
E.により、上皮感染中インビトロ宿主-病原体相互作用を研究するためにアメーバは、上皮細胞と栄養の両方の老舗の文化と連携することが重要である。例えば、以前は、E.アメーバ培養は通常、細菌やtrypanosomatids 22,23の特定の種に関連して確立されていた。 Eのが、共培養アメーバ培養宿主細胞で観察された影響がはっきりとameobasに帰するこ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).
Materials
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/mL |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ mL |
| Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6 Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/mL |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/mL |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24 well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
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