Análise do dano epitelial Produzido pela<em> Entamoeba histolytica</em> Infecção

Summary

A infecção humana por Entamoeba histolytica leva a amebíase, uma das principais causas de diarréia em países tropicais. A infecção é iniciada pelo agente patogénico com as células epiteliais do intestino, provocando a abertura dos contactos célula-célula e, consequentemente, a diarreia, por vezes, seguido por uma infecção do fígado. Este artigo fornece um modelo para avaliar as interações patógeno-hospedeiro iniciais para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese.

Abstract

Entamoeba histolytica é o agente causador da amebíase humana, uma das principais causas de diarréia e abscesso hepático em países tropicais. A infecção inicia-se por interacção do agente patogénico com células epiteliais intestinais. Essa interação leva à ruptura das estruturas intercelulares, como junções apertadas (TJ). TJ garantir a vedação da camada epitelial para separar tecido hospedeiro do lúmen intestinal. Estudos recentes fornecem evidências de que a interrupção do TJ pelo EhCPADH112 proteína parasitária é um pré-requisito para E. invasão histolytica que é acompanhada por disfunção da barreira epitelial. Assim, a análise dos mecanismos moleculares envolvidos na TJ desmontagem durante E. invasão histolytica é de suma importância para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese. Este artigo apresenta um modelo simples que permite a avaliação das interações iniciais patógeno-hospedeiro eo potencial de invasão do parasita. Os parâmetros a serem analisados ​​incluem tresistência eléctrica ransepithelial, interacção de EhCPADH112 com receptores da superfície do epitélio, as alterações na expressão e localização de marcadores epiteliais juncionais e localização das moléculas do parasita no interior das células epiteliais.

Introduction

Entamoeba histolytica é um protozoário única célula responsável da amebíase humano, uma infecção intestinal causando inflamação e diarréia. E. histolytica infecta até 50 milhões de pessoas por ano, mas apenas cerca de 10% das pessoas infectadas desenvolvem os sintomas associados a amebíase ^1. A infecção ocorre após a ingestão de alimentos contaminados ou água contendo E. cistos histolytica. No intestino, os cistos produzir trofozoítos vivos que aderem a mucina do cólon e proliferam ^2. Trofozoítos geralmente formam cistos que são excretados via fezes. Em outros casos, e por razões ainda desconhecidas, trofozoítos quebrar a camada epitelial intestinal e invadir os tecidos subjacentes. No pior dos casos, eles entram na corrente sanguínea e afetar outros órgãos como o fígado ^3.

Quebrando a barreira epitelial requer rompimento de estruturas epiteliais transmembranares que mantêm as células unidas. Célula epitelialos contactos são formados pelo complexo de junções de apicais consistindo apertado (TJ) e conexões aderentes (AJ), e ⁴ desmossomas. As junções mais apicais são TJ e, por isso, eles são a primeira barreira afrontado por E. histolytica e alguns outros agentes patogénicos durante a invasão de host. TJ são compostos de receptores de adesão transmembranares como claudinas, occludin e moléculas de adesão juncional (JAM) que se envolvem em interações heterofílicos homo ou com os receptores da célula vizinha. Eles são intracelularmente ligados por moléculas de andaime dos occludens zonula (ZO) da família de receptores de adesão que se ligam ao citoesqueleto de actina para proporcionar mais resistência mecânica ao epitélio. TJ são responsáveis ​​pela vedação do tecido intestinal do lúmen intestinal, evitando excesso de água e vazamento de soluto. Assim, depois de TJ são interrompidos pelo parasita, os tecidos são invadidos. E. histolytica segrega várias moléculas, tais como: (i) aqueles que estão envolvidos na adesão de amebas para alvet células ^5; (Ii) fatores de membrana ativa participação em morte de células hospedeiras por exocitose, por exemplo, os peptídeos que formam os canais de íon denominado amebaporos ^6,7; e (iii) as proteinases que degradam as proteínas da matriz extracelular e tecido mediam desintegração ^5,8,9.

A protease de cisteína EhCP112 e a molécula de adesão EhADH112 que em conjunto formam o complexo EhCPADH112 são dois E. histolytica virulência proteínas que desempenham um papel importante na desmontagem de TJ ^10. Trofozoítos vivo, seus lisados ​​totais e produtos secretados induzir alterações moleculares no TJ distúrbio complexo e funcional da barreira epitelial. Neste estudo, demonstra-se que EhCP112 e EhADH112 interagir com ocludina e claudina-1 de proteínas que conduzem à internalização e a degradação das proteínas celulares, facilitando, assim, E. entrada histolytica através da via paracelular.

Os dados e os óf outros grupos ^11-17 sugerem fortemente a necessidade de interações patógeno-hospedeiro específicas que permitem a invasão do parasita. Desvendando as bases moleculares destas interações é de extrema importância para uma melhor compreensão da patogênese amebíase. Perturbação selectiva dos TJ por trofozoítos, caracterizado pelo aumento da permeabilidade paracelular, pode ser medido por uma diminuição da resistência eléctrica transepitelial (TER). A transferência de proteínas de parasitas no sentido epitélios host podem ser determinada por imunofluorescência e por microscopia confocal a laser, um método que também pode revelar a co-localização de factores de virulência ameba com marcadores juncionais epiteliais indicando possíveis interacções directas. Neste artigo, vamos descrever em detalhes como células epiteliais e trofozoítos são cultivadas, colhidas e manipuladas para examinar as interações patógeno-hospedeiro e suas consequências.

Protocol

1. Estabelecimento e Manutenção de E. Culturas histolytica Crescer com culturas puras (totalmente livre de todos os outros organismos contaminantes) 1 x 10 5 trofozoítos de Entamoeba histolytica HML tensão: IMSS clonar um 18 em 16 x 125 mm tubos de cultura com tampas de rosca de teflon forro (ou 1 x 10 6 trofozoítos em um descartável T- 25 frascos) e 15 ml (ou 50 ml em frascos T-25) de TYI-S-33 médio (caldo de TYI, suplementado com 3% de vitam…

Representative Results

Para uma E. sucedida cultura histolytica, duas condições importantes devem ser cumpridas: o crescimento em condições axênicas e colheita em fase logarítmica. Anteriormente, culturas de E. histolytica foram prontamente estabelecido em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos 22. No entanto, hoje em dia é comum ter cultivo axênico deste parasita que significa uma subcultura indefinido de amebas em um ambiente livre de bactérias que metabolizam, f…

Discussion

Para o estudo in vitro interações patógeno-hospedeiro durante a infecção epitelial pelo E. histolytica, é fundamental para trabalhar com culturas bem estabelecidas de ambas as células epiteliais e trofozoítos. Por exemplo, antigamente, E. culturas histolytica geralmente tinha sido estabelecida em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos ^22,23. No entanto, a co-cultura de E. culturas histolytica é contraproducente para…

Materials

Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine  0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
				Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min
				Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
				Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/mL
				Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ mL
				Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
				Cell culture plates, 6 Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
				25cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/mL
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/mL
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2
24 well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution