Summary

Análisis del daño epitelial Producido por<em> Entamoeba histolytica</em> Infección

Published: June 12, 2014
doi:

Summary

La infección humana por Entamoeba histolytica conduce a la amebiasis, una causa importante de diarrea en los países tropicales. La infección se inicia por la interacción de agentes patógenos con células epiteliales intestinales, provocando la apertura de los contactos célula-célula y en consecuencia la diarrea, a veces seguido por infección del hígado. Este artículo proporciona un modelo para evaluar las primeras interacciones huésped-patógeno para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la amibiasis.

Abstract

Entamoeba histolytica es el agente causante de la amebiasis humano, una causa importante de diarrea y absceso hepático en los países tropicales. La infección se inicia por la interacción del patógeno con las células epiteliales intestinales. Esta interacción da lugar a una alteración de las estructuras intracelulares tales como uniones estrechas (TJ). TJ asegurar el cierre de la capa epitelial para separar el tejido del huésped de luz intestinal. Estudios recientes demuestran que la interrupción de TJ por la EhCPADH112 proteína parasitaria es un requisito previo para E. invasión histolytica que se acompaña de disfunción de la barrera epitelial. Por lo tanto, el análisis de los mecanismos moleculares implicados en TJ desmontaje durante E. invasión histolytica es de suma importancia para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la amibiasis. En este artículo se presenta un modelo sencillo que permite la evaluación de las interacciones huésped-patógeno iniciales y el potencial de la invasión del parásito. Parámetros que deben analizarse incluyen tresistencia eléctrica ransepithelial, la interacción de EhCPADH112 con receptores de la superficie epiteliales, cambios en la expresión y localización de marcadores epiteliales de unión y localización de moléculas de parásitos dentro de las células epiteliales.

Introduction

Entamoeba histolytica es un protozoo único responsable de la amibiasis humana, una infección intestinal de células causando inflamación y diarrea. E. histolytica infecta a 50 millones de personas al año, pero sólo alrededor del 10% de las personas infectadas desarrollan los síntomas asociados a la amibiasis 1. La infección se produce por ingestión de alimentos contaminados o agua que contiene E. quistes histolytica. En el intestino, quistes producen trofozoítos en vivo que se adhieren a la mucina de colon y proliferan 2. Los trofozoítos suelen formar quistes que se excretan a través de las heces. En otros casos y por razones aún desconocidas, trofozoítos rompen la capa del epitelio intestinal e invaden los tejidos subyacentes. En el peor de los casos, entran en el torrente sanguíneo y afectan a otros órganos como el hígado 3.

Rompiendo la barrera epitelial requiere la interrupción de las estructuras epiteliales transmembrana que mantienen las células unidas. Célula epitelialcontactos se forman por el complejo de unión apical que consiste de apretado (TJ) y uniones adherentes (AJ), y desmosomas 4. Las uniones más apical son TJ, y por lo tanto, que son la primera barrera afrentado por E. histolytica y algunos otros patógenos durante la invasión del huésped. TJ se componen de los receptores de adhesión transmembrana como claudins, occludin y moléculas de adhesión de unión (JAM) que se dedican a la homo-o interacciones heterófilos con receptores de la célula vecina. Están intracelularmente obligados por moléculas de andamio de los zonula occludens (ZO) de la familia que se conectan los receptores de adhesión a citoesqueleto de actina para proporcionar más resistencia mecánica al epitelio. TJ son responsables para el sellado de tejido intestinal desde el lumen intestinal, evitando que el agua excesivo y fugas de soluto. Así, después de TJ se interrumpen por el parásito, los tejidos son invadidos. E. histolytica segrega varias moléculas tales como: (i) los implicados en la adhesión de las amebas a Target células 5; (Ii) factores activos de membrana que participan en la destrucción de las células huésped por exocitosis, por ejemplo, los péptidos que forman canales iónicos denominados amoebapores 6,7; y (iii) las proteinasas que degradan las proteínas de la matriz extracelular y median tejido desintegración 5,8,9.

La proteasa cisteína EhCP112 y la molécula de adhesión EhADH112 que en conjunto forman el complejo EhCPADH112 son dos E. histolytica virulencia proteínas que desempeñan un papel importante en el desmontaje de TJ 10. Trofozoítos vivo, sus lisados ​​totales y productos secretados inducen cambios moleculares en la perturbación compleja y funcional TJ de la barrera epitelial. En este estudio, se muestra que EhCP112 y EhADH112 interactúan con ocludina y claudina-1 proteínas que conducen a la internalización y la degradación de proteínas de la célula, facilitando de este modo E. entrada histolytica a través de la ruta paracelular.

Nuestros datos y los Of otros grupos 11-17 sugieren fuertemente la necesidad de las interacciones huésped-patógeno específicos que permiten la invasión del parásito. Revelación de la base molecular de estas interacciones es de suma importancia para una mejor comprensión de la patogénesis de la amebiasis. Perturbación selectiva de TJ por trofozoitos, caracterizado por aumento de la permeabilidad paracelular, se puede medir por una disminución en la resistencia eléctrica transepitelial (TER). La transferencia de las proteínas parasitarias hacia epitelios huésped puede ser determinado por tinción de inmunofluorescencia y microscopía láser confocal, un método que también puede revelar co-localización de los factores de virulencia de ameba con marcadores epiteliales de unión que indican posibles interacciones directas. En este artículo, describimos en detalle cómo se cultivan, cosechan y se manipulan para examinar las interacciones huésped-patógeno y sus consecuencias células epiteliales y trofozoítos.

Protocol

1. Establecimiento y mantenimiento de E. Culturas histolytica Crecer axénicamente (totalmente libre de todos los demás organismos contaminantes) 1 x 10 5 trofozoítos de Entamoeba HML cepa histolytica: IMSS clon A 18 en 16 x 125 mm tubos de cultivo con teflón tapones de rosca de línea regular (o 1 x 10 6 trofozoítos en una desechable T- matraz de 25) y 15 ml (o 50 ml en matraz T-25) de TYI-S-33 medio (caldo de TYI suplementado con 3% de…

Representative Results

Para una E. éxito cultura histolytica, dos importantes condiciones debe cumplirse: el crecimiento en condiciones axénicas y cosecha en fase logarítmica. Anteriormente, cultivos de E. histolytica se establecieron fácilmente en asociación con ciertas especies de bacterias o tripanosomátidos 22. Sin embargo, hoy en día es común tener cultivos axénicos de este parásito es decir, un subcultivo indefinida de amebas en un ambiente libre de bacterias que metabolizan, hongos, proto…

Discussion

Con el fin de estudiar in vitro las interacciones huésped-patógeno durante la infección epitelial por E. histolytica, es fundamental trabajar con culturas bien establecidos de ambas células epiteliales y trofozoítos. Por ejemplo, anteriormente, E. culturas histolytica usualmente se habían establecido en asociación con ciertas especies de bacterias o tripanosomátidos 22,23. Sin embargo, el co-cultivo de E. culturas histolytica es contraproducente pa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).

Materials

Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A  IMSS Hospital, Mexico Without/number Virulent trophozoites18 
TYI broth Becton, Dickinson and Company
Merck
Merck
Merck
J.T. Baker
Reproquifin
SIGMA-Aldrich
SIGMA-Aldrich
211862
K35625437 626
21578
4873
3252-01
CAS 50-81-7
C7880
F-5879
3.45% BBL Biosate peptone
58 mM glucose
39 mM NaCl
5 mM KH2PO4
6.5 mM K2HPO4
16.3 mM ascorbic acid
8.1 mM L-cysteine
 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult Microlab , Labs., Mex. SU146 Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80 In vitro SR-07 Use at 3%
Penicillin  Lakeside,  Méx. 34564SSA IV 0.5 IU/mL
Streptomycin  Lakeside,  Méx. 75757SSA IV 35 µg/ mL
Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps Corning-Pyrex 9826-16X 16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6 Well Corning-Costar 3516 Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25cm2 cell culture flask Corning-Costar 430168 Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I American Type Culture Collection CCL34 Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium  Gibco  12800-017 Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum In vitro S-02 Use at 10%.  
Penicillin/Streptomycin mixture  In vitro  A-01 Stock solution 10,000 U/µg/mL
Insulin   AMSA 398MJ94SSA IV Stock solution 100 IU/mL
Trypsin solution  In vitro EN-005 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75cm2 cell culture flask Corning-Costar 430720 Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports Corning-Costar 3470 0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2
24 well cell culture dish   Corning-Costar 3524 Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini Roche 11836 153 001 Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM 
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) SIGMA-Aldrich E3132 Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL
pαZO-1  Invitrogen 402200 IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112 Homemade antibody Without/ Number IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM Zymed 62-6811 Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) Zymed 816114 Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode World Precision Instrument  102711 Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter World Precision Instrument  12111 Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber MEARIENFELD 610610 Hemocytometer 
Leica TCS_SP5_MO Leica Without/number Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield Vector Laboratories, Inc. H-1000 Mounting medium for fluorescence
4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi) SIGMA D-9542 0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A-1310 0.5%  final concentration for blocking solution

References

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Betanzos, A., Schnoor, M., Javier-Reyna, R., García-Rivera, G., Bañuelos, C., Pais-Morales, J., Orozco, E. Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection. J. Vis. Exp. (88), e51668, doi:10.3791/51668 (2014).

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