قياس معدل الأيض في<em> ذبابة الفاكهة</em> باستخدام قياس التنفس
Summary
الاضطرابات الأيضية هي من بين واحدة من الأمراض الأكثر شيوعا لدى البشر. نموذج كائن لين العريكة وراثيا D. ويمكن استخدام البطن لتحديد الجينات الرواية التي تنظم عملية التمثيل الغذائي. وتصف هذه الورقة طريقة بسيطة نسبيا والتي تسمح بدراسة معدل الأيض في الذباب عن طريق قياس إنتاجها CO 2.
Abstract
الاضطرابات الأيضية هي مشكلة متكررة تؤثر على صحة الإنسان. وبالتالي، فهم الآليات التي تنظم عملية التمثيل الغذائي هي مهمة علمية حاسمة. المرض يسبب العديد من الجينات في البشر لها نديد ذبابة، مما يجعل ذبابة الفاكهة نموذجا جيدا لدراسة مسارات الإشارات المشاركة في تطوير اضطرابات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، فإن قابلية الإستطراق من ذبابة الفاكهة يبسط شاشات الجينية للمساعدة في تحديد الأهداف العلاجية الرواية التي قد تنظم عملية التمثيل الغذائي. من أجل أداء هذه الشاشة طريقة بسيطة وسريعة لتحديد التغيرات في التمثيل الغذائي للدولة من الذباب هو ضروري. بشكل عام، وإنتاج ثاني أكسيد الكربون هو مؤشر جيد للأكسدة الركيزة والطاقة النفقات وتوفير المعلومات حول حالة الأيض. في هذا البروتوكول ونحن نقدم طريقة بسيطة لقياس CO 2 الناتج من الذباب. هذه التقنية يمكن أن يحتمل أن تكون مساعدة في تحديد الاضطرابات الوراثية التي تؤثر على معدل الأيض.
Introduction
دورة البيوكيميائية كريب يولد ATP من خلال الأكسدة من خلات المستمدة من الكربوهيدرات والدهون والبروتينات وإنتاج ثاني أكسيد الكربون 2. في ذبابة الفاكهة، ويرتبط O 2 مدخلات مباشرة مع CO 2 الناتج ويعكس مستوى التمثيل الغذائي 1. وبالتالي، فقد استخدمت بنجاح قياس CO 2 الناتج في الدراسات المتعلقة بالشيخوخة والتمثيل الغذائي 2-5. هنا مختبرنا وتعديل الاجهزة التجريبية المصممة مسبقا، مما يتيح قياس ثاني أكسيد الكربون 2 في إنتاج ما يصل إلى ثمانية عشر عينات دون الحاجة إلى أي معدات متخصصة. الآخرين، ونحن قد استخدمت سابقا هذه الطريقة لإظهار الفروق في معدلات الأيض في الذباب التي تعاني من نقص في البروتين العضلي ضمور المرتبطة بها، Dystroglycan (المديرية العامة) 6-8.
O 2 تستخدم لالأيض المؤكسدة يتم تحويلها إلى CO 2، الذي طرد في حاوية نفايات في الجهاز التنفسي. والإنشاءاتيوصف نشوئها قياس التنفس المصنوعة يدويا التي تسمح لتحديد معدل استهلاك O 2. يتم وضع الذباب في حاوية مغلقة مع المادة التي تمتص ثاني أكسيد الكربون طرد 2، والقضاء بكفاءة من المرحلة الغازية. ويتم قياس التغير في حجم الغاز (الضغط انخفض) عن تشريد السائل في الزجاج الشعرية التي تعلق على مقياس التنفس مغلقة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة مع الآخرين هو التكلفة. وقد تقاس الدراسات السابقة CO 2 الانتاج بمقدار ذبابة الفاكهة باستخدام محللات الغاز وأنظمة قياس التنفس تقدما من الناحية التقنية 1،9. على الرغم من المعدات أكثر تعقيدا، وحساسية الطريقة الموصوفة هنا يشبه القيم ذكرت (الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت العديد من المجموعات الأخرى من الاختلافات هذه التقنية لتحديد معدلات التمثيل الغذائي النسبي في ذبابة الفاكهة 4-6. لذلك، هذا الاختبار يمكن استخدامها لتوليد reliabجنيه، والبيانات ذات الصلة استنساخه لذبابة الفاكهة الأيض دون شراء المعدات المتخصصة التي يمكن أن تكون في أي مختبر الإعداد، ويمكن استخدامها لأغراض تعليمية.
بشكل عام، تقنيات مقبولة لتحديد التمثيل الغذائي للكائن الحي هو قياس CO 2 تنتج، وO 2 المستهلكة، أو كليهما 3،4،9. رغم ذلك، فإنه يمكن الافتراض أن ما يعادل واحد من O 2 يولد ما يعادل واحد من ثاني أكسيد الكربون 2، ونسبة دقيقة من CO 2 إنشاؤها تعتمد على الركيزة الأيض تستخدم 10. وبالتالي، لتحديد بدقة معدل الأيض في وحدات الطاقة فمن الضروري قياس كل من O 2 CO 2 المستهلكة والمنتجة. ونتيجة لهذا، فإن الطريقة الموصوفة هنا هو ذات الصلة على وجه التحديد لمقارنة الاختلافات في CO 2 الإنتاج بين الحيوانات وليس قيمة مطلقة. أسلوبنا يدمج متعددة الحيوان CO 2 الإنتاج على مدى فترة من تيمه (1-2 ساعة) وبالتالي إرجاع متوسط النشاط الحيوانات. إذا كان هناك سبب للاعتقاد بأن حيوانات التجارب هي أقل نشاطا من الحيوانات سيطرة القياس يمكن أن تعكس مستويات مختلفة من النشاط وليس بالضرورة عملية التمثيل الغذائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة غير مكلفة ويمكن الاعتماد عليها لقياس ثاني أكسيد الكربون 2 الإنتاج في الذباب. وجدنا أن هذه التجربة هي سهلة وسريعة لإجراء ويولد بيانات قابلة للتكرار وهذا هو في اتفاق مع دراسات أخرى 1، 6، 9. بروتوكول المذكورة هنا يمكن تعديلها ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر جمعية ماكس بلانك لتمويل أبحاثنا.
Materials
| BlauBrand IntraMark 50µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Twezzers | Any |
References
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).
- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takeuchi, K., et al. Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants. Science. 323, 1740-1743 (2009).
- Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components. 발생학. 352, 228-242 (2011).
- Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles. Scientific Reports. 1, 47 (2011).
- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. 유전학. 169, 231-242 (2005).
- Elia, M. Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques. The American Journal of Physiology. 260, (1991).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Bharucha, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism. Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, 38 (2013).
