La medición de la tasa metabólica en<em> Drosophila</em> Mediante respirometría
Summary
Los trastornos metabólicos se encuentran entre una de las enfermedades más comunes en los seres humanos. El modelo de organismo genéticamente manejable D. melanogaster se puede utilizar para identificar nuevos genes que regulan el metabolismo. Este artículo describe un método relativamente sencillo que permite el estudio de la tasa metabólica en las moscas de la medición de su producción de CO 2.
Abstract
Trastornos metabólicos son un problema frecuente que afecta a la salud humana. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos que regulan el metabolismo es una tarea científica fundamental. Muchos de los genes que causan enfermedades en los seres humanos tienen un homólogo mosca, haciendo Drosophila un buen modelo para estudiar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de diferentes trastornos. Además, la maleabilidad de Drosophila simplifica pantallas genéticos para ayudar en la identificación de nuevas dianas terapéuticas que puedan regular el metabolismo. Con el fin de realizar una pantalla de este tipo es necesario un método sencillo y rápido para identificar los cambios en el estado metabólico de las moscas. En general, la producción de dióxido de carbono es un buen indicador de los gastos de oxidación del sustrato y la energía que proporciona información sobre el estado metabólico. En este protocolo se introduce un método simple para medir el CO 2 de salida de las moscas. Esta técnica potencialmente puede ayudar en la identificación de las perturbaciones genéticos que afectan la tasa metabólica.
Introduction
El ciclo bioquímico de Krebs genera ATP a través de la oxidación de acetato derivado de los carbohidratos, las grasas y las proteínas que producen CO 2. En Drosophila, O 2 de entrada está directamente relacionada con la producción de CO 2 y refleja el nivel de metabolismo 1. Por lo tanto, la medición de CO 2 de salida ha utilizado con éxito en los estudios relacionados con el envejecimiento y el metabolismo de 2-5. Aquí nuestro laboratorio ha modificado montajes experimentales previamente diseñados, lo que permite la medición de la producción de CO 2 en un máximo de dieciocho muestras sin necesidad de equipo especializado. Otros y hemos utilizado anteriormente este método para mostrar las diferencias en las tasas metabólicas en las moscas que son deficientes en la proteína de la distrofia muscular asociada, Distroglicano (Dg) 6-8.
O 2 utilizado para el metabolismo oxidativo se convierte en CO 2, que es expulsado como residuos respiratoria. La construcciónción de respirómetros hechas a mano se describe que permite la determinación de la tasa de O 2 consumido. Las moscas se colocan en un recipiente sellado con una sustancia que absorbe CO 2 expulsado, eliminando de manera eficiente desde la fase gaseosa. El cambio en el volumen de gas (disminución de la presión) se mide por el desplazamiento de fluido en un capilar de vidrio unido a la respirómetro cerrado.
La principal ventaja de esta técnica sobre otros es el costo. Estudios previos han medido la producción de CO2 por Drosophila utilizando analizadores de gases y sistemas de respirometría técnicamente avanzados 1,9. A pesar de el equipo más complejo, la sensibilidad del método descrito aquí es similar a los valores reportados (Tabla 1). Además, varios otros grupos han utilizado variaciones de esta técnica para determinar las tasas metabólicas relativas en Drosophila 4-6. Por lo tanto, este ensayo se puede usar para generar reliable, datos reproducibles relevantes para el metabolismo de Drosophila sin la compra de equipo especializado que puede ser configurado en cualquier laboratorio y se puede utilizar con fines educativos.
En general, las técnicas aceptadas para determinar el metabolismo de un organismo es medir el CO 2 producido, el O 2 consumido, o ambos 3,4,9. Aunque, se puede suponer que un equivalente de O 2 genera un equivalente de CO 2, la relación precisa de CO 2 generado es dependiente sobre el sustrato metabólico utilizado 10. Por lo tanto, para determinar con precisión la tasa metabólica en unidades de energía que es necesario medir ambos O 2 consumido y CO 2 producido. Debido a esto, el método descrito aquí es específicamente relevante para la comparación de las diferencias en la producción de CO 2 entre los animales y no el valor absoluto. Nuestra técnica se integra animales CO producción múltiple 2 durante un período de timE (1-2 horas) y por lo tanto devuelve un promedio de la actividad de los animales. Si hay razones para creer que los animales de experimentación son menos activos que los animales de control de la medición podría reflejar diferentes niveles de actividad y no necesariamente el metabolismo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se describe un método de bajo costo y confiable para medir la producción de CO 2 en las moscas. Hemos encontrado que este experimento es fácil, rápido de realizar y genera datos reproducible que está de acuerdo con otros estudios 1, 6, 9. El protocolo descrito aquí se puede modificar fácilmente para adaptarse a presupuesto y materiales disponibles de cualquier laboratorio. La construcción de cada respirómetro individuo puede adaptarse, siempre y cuando la cámara permane…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a la Sociedad Max-Planck para la financiación de nuestra investigación.
Materials
| BlauBrand IntraMark 50µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Twezzers | Any |
References
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