Abstract
ショウジョウバエにおけるポスト胚発生のかなりの部分、 キイロショウジョウバエは 、成虫と呼ばれる袋状構造のセット内で行われます。これらのディスクは、大人のハエ内で発見された成人の構造の割合が高いを生じさせる。ここでは、これらのディスクを回復し、抗体、転写レポーターとタンパク質トラップを用いた分析のためにそれらを準備するために最適化されたプロトコルを記述します。この手順では、成虫のような薄い組織に最も適しているが、簡単にそのような幼虫の脳と大人の卵巣厚い組織に使用するために修正することができます。書かれたプロトコルとそれに付随するビデオは3齢幼虫、組織の固定、および抗体と成虫の治療の切開を介してリーダ/ビューアをご案内いたします。プロトコルは、同様に若い第一及び第二齢幼虫から成虫を分析するために使用することができます。このプロトコルの利点は、比較的短く、それがいることである解剖した組織の高品質保持のために最適化が備わっています。別の利点は、使用される固定手順ショウジョウバエタンパク質を認識する抗体の圧倒的な数でうまく動作することである。われわれの経験では、この手順ではうまく機能しない敏感な抗体の非常に小さな数があります。このような状況では、救済策は、私たちが解剖工程および抗体インキュベーションのために記載されているガイドラインに従うことを継続しながら、代替の固定カクテルを使用することであるように思われる。
Introduction
一世紀以上ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエの場合は、開発、行動や生理機能を研究するための最高のシステムとなっている。成虫1-3と呼ばれる単層の上皮内後者の撮影場所の多くで胚および後胚：ハエにおける開発は、二つの大きな段階に分けることができる。 成虫の図面は最初の昆虫開発1の彼の広範な研究論文の一部として8月ワイスマンによって1864年に出版された。これらのディスクは、1〜14のフライ 、大人内で発見された成人の構造の割合が高いを生じさせ、最終的には初期の蛹の段階の大規模な組織分解を生き残る、と、幼虫の段階でパターニングして、胚形成の間彼らの開発を開始。幼虫の開発中に各ディスクには運命、形状やサイズに関するいくつかの重要な決定を行う。第一及び第二の幼虫齢の中では、ディスクはestablisは、原発運命を採用する使命を帯びている正確な形状を採用し、セル15〜16の必要な数を生成し、コンパートメントの境界を興。第三の幼虫齢と初期のプレ蛹段階では、成虫は分裂を続け、細胞がそれらの端末の運命16を採用するようにパターニングする。
ショウジョウバエ発生生物学の初期の歴史の中で、成虫は正常な発達との関連で、損失または機能獲得変異体が生存された限られたケースではほぼ独占的に研究した。幼虫および成体組織内の細胞クローン中で分析される致死突然変異のために許可された有糸分裂組換えを誘導するX線の使用。この方法は、幼虫および成体の両方の組織における損失と機能獲得型突然変異を分析するためにトランスジェニック法の導入により改善されている。野生型および変異型の組織の分子景観を説明するための抗体の転写レポーターおよびタンパク質トラップの数も定数であるantly成長。損失を分析し、機能獲得型変異細胞クローンするために、これらの分子マーカーを使用すると、突然変異細胞は、発達中にその野生型いとこから逸脱方法のリアルタイムの理解を得ることがますます可能になった。適切にこれらのツールおよび試薬を利用するためには、閲覧撮影し分析することができる成虫の高品質の製剤を有することが重要である。この原稿の目標は、目を触角複合体（ 図1A）の単離および調製のための最適化されたプロトコルを提供することです。また、正常翼、平均棍、T1-T3脚および性器（ 図1B-E）を生じるものを含む追加のディスクの多種多様な単離することができる。この手順は、わずかな変更で、ほぼ80年間、 ショウジョウバエ成虫を単離するために使用されている。
ほとんどの遺伝子は、ミュー中に発現されているので、上記のように発達段階ltipleおよび組織の多数では、動物が三齢幼虫期前によく死ぬようにヌル変異体が眼全体に与える影響を研究するために、多くの場合不可能です。 4つの方法は、網膜などの先進の組織の研究は著しくより扱いやすくなりました。最初は、そうでなければ、野生型組織17-19内の変異体細胞クローンを生成するフリッパーゼ（FLP）/フリッパーゼ換えターゲット（FRT）メソッドです。この場合、変異体組織は、緑色蛍光タンパク質（GFP）のような視覚的なマーカーの非存在により識別され、GFPの存在する周囲の野生型組織（ 図2D）と比較することができる。二つ目は、導入遺伝子が細胞20の集団において発現している「FLPアウト」方式である。この場合、細胞クローンは、GFPレポーターを欠いている周囲の野生型組織（ 図にGFPの存在によって同定され、比較される2E）。第三は、FLP / FRT突然変異体クローンとFLPアウト発現システム21の要素を組み合わせた抑制性細胞マーカー（MARCM）技術とモザイクの分析である。この方法では、導入遺伝子を同時に個体の遺伝子座のための突然変異体である細胞の集団内で表現することができる。 FLPアウトクローンと同様に、MARCMクローンは、GFPの存在によって同定およびGFPマーカー（ 図2F）を欠いている周囲の野生型組織と比較している。最後に、遺伝子及びRNAi構築物は、特異的プロモーター-GAL4構築物の制御下成虫組織内で発現させることができる。変異または過剰発現クローンまたはパターンが直接隣接野生型組織と比較することができるので、これらの4つの方法は、成虫の研究に関心が高まっている。この手順に記載された方法が開発されているように、ショウジョウバエでは、成体組織の後胚発生を研究、研究者、特に目を触角から誘導されるものが、分析のために高品質の組織を得ることができるであろう。個別の研究者は、わずかな変更を行ってきたが、（私たちはここで説明する）この手順のコアは、大部分が変更されていないままである。高品質の組織を得ることが私たちは、この書かれたプロトコルとそれに付随するビデオは貴重な教育資源として役立つことを願ってい成虫の研究に重要であることから。
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Protocol
幼虫の調製
- 解剖バッファーで35ミリメートルペトリ皿を埋める。
- ペトリ皿に幼虫を置き、それらを数分間（セルフクリーニング工程）の周りに泳ぐことができます。
- シリコーン系解剖板に解剖バッファーのプールに幼虫を転送します。このプールは、プレートの一方の端にあるべきである。解剖板はガラスシャーレ内注入し、硬化したシリコーン溶液で構成されています。
- パスツール·ピペットを用いて、解剖プレートの中央に解剖バッファの大きなプールを配置します。
- ＃5鉗子を使用して、解剖バッファの大きなプールに小さなプールから単一の清掃幼虫を移す。
幼虫の2。粗い解剖
- 幼虫は解剖バッファーの大きなプールの中にある間にピンセットで幼虫を握る。鉗子の他のペアがアニムを保持するために使用される鉗子の一組は、口フックをつかむために使用されるべきであるまだら（1月3日体長穏やかに幼虫をつかむ）。
- すぐに鉗子の第二の対を廃止本体の残りの部分を引っ張りながら、口のフックの近くでキューティクルを含む一対の鉗子を安定保持します。
- 幼虫は引き裂くし始めると、あなたは緊張のわずかな解放を感じるだろう。鉗子から幼虫を放し、こぼれにする幼虫の "根性"を可能にします。これは成虫が通常の立体配座に留まることを可能にし、変形することを防ぎます。
- 鉗子の1対の場所で幼虫の先端部を保持するために、再び口のフックを持ってください。鉗子の他のペアを使用すると、内側の内臓を含めた幼虫の下部3分の2を削除します。注：口のフック、アイ触角ディスク、脳半球、腹側神経節、唾液腺、いくつかの脚ディスク、およびその上のキューティクルを含む複合体が残ります。
- ピンセットでそっとキューティクル、唾液腺、脚ディスクを覆う取り外し、他の組織。注：残るべき唯一の組織は、口のフック、アイ触角ディスク、脳半球、および腹側神経節（ 図3）である。
- 繰り返します15〜20分間の追加の幼虫を2.1から2.5を繰り返します。注：より長期間解剖バッファーに残って成虫が低下する傾向があり、最終的に撮影するのに理想的な試験体よりも小さいとして表示されます。このように、20分の最大後に全ての解剖した組織は、（下記参照）のPLP固定液に転送する必要があります。
抗体を用いた3。固定および組織の染色
- P-200ピペットマンを使用して、冷たいパラ - リジン - 素酸（PLP）固定液を含む時計皿に解剖した組織を移す。 50μlのに移し解剖バッファの限界容積がPLPの希釈を最小限にする。先端開口が解剖した組織を収容するのに十分な大きさであるように、カミソリの刃で先端をカットしてください。ピンセットを使用したか、タングステン針を切開した組織が完全に適切な固定が起こるようにするために沈めていることを確認します。 45分間冷たいPLP固定液中で解剖した組織をインキュベートする。このインキュベーションは撹拌せずに室温で行うことができる。
- P-200ピペットマンを使用して、45分間の別のカット黄色のチップを使用してバッファ（RT）を洗浄するために解剖した組織を移す。 50μlのに移しPLPの限界容積が洗浄緩衝液の希釈を最小限にする。注：すべての解剖した組織を完全に沈めなければならない。
- 1.5mlマイクロチューブに解剖した組織の20〜30セットを転送します。注：アイ触角複合体のより大きな数がチューブ内で結合している場合、チューブの底の組織を抗体に適切に曝露されない可能性がある。最適な結果を得るためにはせいぜい20〜30人目触角複合体は、単一の管内に存在してはならない。解剖した組織は、マイクロチューブの底に沈殿します。そのため、後工程でのuの削除し、洗浄緩衝液、ブロッキング溶液、および抗体を交換するピペットマンをSE。
- 洗浄バッファーを削除し、ブロッキング溶液100μlで置き換えます：洗浄緩衝液中10％正常ヤギ血清。 10分間、卓上回転装置上で穏やかに回転しながら室温でインキュベートする。
- ブロッキング溶液を除去し、適切に10％正常ヤギ血清中で希釈された一次抗体を100μlと交換してください。 16時間穏やかに回転しながら室温でインキュベートする。
- 一次抗体を取り出し、洗浄バッファー750μlのと交換してください。場所チューブニューテーター上で10分間室温で章動させることを可能にする。注：一次抗体（4℃で保存）保存し、後で再利用することができます。複数回の抗体を再利用する非特異的結合を減らすのに役立つ。
- ヘッドはその後、チューブの底に沈殿の洗浄緩衝液を除去し、適切に10％正常血清中で希釈された二次抗体を100μlを追加することができます。 2̵穏やかに回転させながら、室温でインキュベートする1; 4時間。
- 組織から二次抗体溶液を取り出し、洗浄緩衝液500μlと交換してください。組織がチューブの底に沈殿することを許可する。
- P-200およびカット黄色のチップを用いて、解剖皿に置かれた洗浄緩衝液のプールにすべての解剖組織を移す。細かい解剖の次のステップに進む一方で、組織は、洗浄緩衝液中でインキュベートします。これは、過剰な二次抗体を除去するのに役立ちます。
4。アイ触角複合体の微細解剖及びスライド上にマウントする
- 下向きの複合体の腹側で口フックによりキューティクルを握るために鉗子の一組を使用してください。鉗子の第二の対では、脳と目のディスクの間の空間にします（ 図3、赤矢印）を第二の鉗子を閉じて速やかに口のフックから離れて脳を引いて2脳ローブを削除します。
- 口のフックに押したまま、ピンチオフアイ触角の触角部分と口のフック（ 図3、青色の矢印）との間の接続にできるだけ近い組織。注：アイ触角錯体は、すべての組織（ 図1A）があってはならない。スライド上に配置することができたいすべての所望の組織を解剖されるまで続けます。このプロトコルは、翼、平均棍、脚および性器成虫（ 図1B-E）を単離するために適合させることができる。
- ティッシュペーパー（カバーガラスのサイズ）の2つの小片を約3インを追加します。離れて解剖皿に。皿の上にガラススライドを置きます - ティッシュペーパー2枚のスライドの端の下でなければなりません。これは解剖皿のシリコーンベースに付着するスライドを防ぐことができます。
- ノーカットチップでP-20を使用して、顕微鏡用スライドガラスの中央に抗漂白剤の9μlを添加する。蛍光で見たときにこれは、組織の漂白を防ぐ軽い。
- 同じノーカットチップを使用して、すべての目を触角ディスクを収集し、抗漂白試薬の滴に追加します。引き継がれ、洗浄緩衝液の量を最小限に抑えます。 10μlの以下の洗浄緩衝液の量を制限してみてください。
- 抗漂白試薬の滴内に目を触角ディスクを分離し、広げるためにピンセットを使用してください。ディスクが数分間抗漂白試薬にインキュベートすることを許可する。注：組織は抗漂白試薬を吸収するようにディスクが明確になります。
- 細かい絵筆を使って静かに試料上にカバースリップを下げる。これは、気泡の形成を防止する。
- Storeは光や蛍光顕微鏡を使用して人目を触角や他の成虫を表示する直前まで、-20℃でスライドする。
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Representative Results
確実に上述した方法は、その場プローブ 、転写レポーター、タンパク質トラップおよび抗体中での分析のための高品質の素材を生成します。 図1では、私たちが日常的にこの方法で回収されたアイ·アンテナ、性器、翼、平均棍と脚のディスクを表示します。これらのディスクは、F-アクチンに結合し、従って、各セルの概要を説明ファロイジン結合体化フルオロフォアで処理した。組織はその後、適切に目のディスクの形態形成溝を固定されている場合は、生殖器における同心の組織襞の縁、触角、脚ディスク、翼と平均棍ディスクの背腹軸はすべてシャープなエッジを表示されます。組織が 適切に固定されている場合は、抗体、蛍光タンパク質およびin situプローブにおいても、シャープなパターンを明らかにする。いくつかの例が図2に示されている。ながら異なる抗体で染色された上部つのパネルディスプレイディスク下位3のパネルは、GFPは、細胞の集団をマークするために使用されるディスクを示す。
アイ触角の最も顕著な特徴の一つは、背腹軸1,22に沿って走る組織内のインデントとして見ることができる形態形成溝（ 図1A）、である。前に第三の幼虫齢に内のすべてのセル現像の目は、パターン化されていない未分化、及び互いから形態学的に区別できない。第三の幼虫齢の開始時に形態形成溝は、目のフィールドの後縁で開始し、眼/触角ボーダー22に向かって前方に進行する。溝が目の視野にわたって進行すると無秩序な細胞の海は周期的に離間ユニット目や個眼（ 図1A）22-23の規則配列に変換される。控え畝間のPax6のホモログアイレス（EY）のチャンネルセルを含む遺伝子調節ネットワークは目の運命（ 図2A）15に向けて。畝間自体の開始および進行は経路24-29シグナリングヘッジホッグ（HH）とデカペンタプレジック（DPP）の活動に依存している。実際、DPP-lacZレポーターは忠実に溝（ 図2B）30-31内のDPP遺伝子座の発現を反映する。細胞は、溝を出て、その端末の運命を採用し始めると、それらは、タンパク質（ 図2C）32-34 結合汎神経RNAをコードしている胚性致死視覚異常（ELAV）のような細胞特異的マーカーを発現する。
図1。 キイロショウジョウバエの成虫。（
アイ成虫原基の図2クローンと発現解析（A - F）。目成虫の共焦点画像。 （A）Pax6のタンパク質アイレス（Eyの）が広く進ん形態形成溝の配布されています。 （B）は 、DPP-lacZの転写reporterはHhシグナルに応答し、形態形成溝内で発現される。 （C）汎神経細胞のRNA結合タンパク質ELAVは形態形成溝の背後にあるすべての開発の感光体に分布している。 （D）FLP / FRTシステムによって生成機能喪失型クローンを含有する眼用ディスク。クローンは、GFP（E）の欠如によって同定される。 FLPアウトシステムで生成された過剰発現クローンを含む目のディスク。クローンを積極的にGFPでマークされています。 （F）MARCMクローンを含む目の ディスク。 FLPアウトシステムのように、MARCMクローンは、GFPの存在によって同定することができる。すべての検出されたタンパク質と遺伝子型がFigure内に表示されます。前方が右にあり、背側はアップしています。
図3。アイアンテナ-脳の複雑な。SCH初日粗い解剖製品のematic描画。修正されるべき唯一の組織は、口のフック、アイアンテナディスクや脳（ - 示されていない多くの場合、腹側神経節も同様に付着したままになる）である。紫=脳、緑=アイアンテナディスク、ブラウン=口のフック。前方には、右側にあります。足、翼、平均棍と性器ディスクを解剖する場合は、幼虫の外側のキューティクルは、依然としてこれらの組織に装着する必要があります。さまざまな抗体、ブロックおよび洗浄ソリューションを通じて、その後の転送中に成虫を失う可能性があるため、上にあるキューティクルを削除しないでください。過剰な組織が微細な切開ステップ（4.1-4.2）の間に除去することができる。
図4 ショウジョウバエの幼虫内の成虫の位置付け。スキーマ3齢幼虫内のアイアンテナ、足、翼、平均棍と性器ディスクの相対位置のチック描画。アイ触角が緑色に着色され、脚ディスクは青色であり、ホルターネックディスクが紫である、翼ディスクはオレンジ/茶色にあり、性器ディスクが淡褐色である。前方には、右側にあります。
| ソリューションの名前 |
| 8％のパラホルムアルデヒド |
| 0.2Mのリン酸ナトリウム一塩基 |
| 0.2Mのリン酸ナトリウムDisbasic |
| 1 N水酸化ナトリウム |
| 10％トリトン |
| 0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液（解剖バッファ） |
| 0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液+ 0.1％トリトン（洗浄バッファー） |
| リジンバッファー |
| 2％パラホルムアルデヒド-リジン素酸固定液（PLP） |
| 10％正常ヤギ血清 |
表1：必要な溶液のリスト。
| 8％パラホルムアルデヒド原液 |
| 50ミリリットルの三角フラスコに以下を追加します。 |
| 2.0グラムのパラホルムアルデヒド |
| 蒸留水23.0ミリリットル |
| 1Nの水酸化ナトリウムを4.0滴（ガラスパスツールピペットから） |
| 溶液を、穏やかな沸騰に達するまで攪拌プレート上で混合し、ヒート |
| パラホルムアルデヒドが完全に溶解するまで穏やかに沸騰することを許可する |
| 冷たいまで氷上に置いてください（前各解剖に新鮮にする） |
| 0.1Mのリン酸緩衝液（解剖（P）バッファ） |
| 50ミリリットルコニカルチューブに以下を追加します。 |
| 18.0ミリリットルの0.2Mリン酸ナトリウム二塩基 |
| 7.0ミリリットルの0.2Mリン酸ナトリウム一塩基 |
| 25.0ミリリットルの蒸留水 |
| 4℃（1週間の貯蔵寿命）で保存 |
| 0.1Mのリン酸+洗剤液（ウォッシュ（W）バッファ） |
| 50へmlのコニカルチューブには、以下を追加します。 |
| 18.0ミリリットルの0.2Mリン酸ナトリウム二塩基 |
| 7.0ミリリットルの0.2Mリン酸ナトリウム一塩基 |
| 25.0ミリリットルの蒸留水 |
| 0.5ミリリットル10％トリトン |
| RTでストア（1週間の貯蔵寿命） |
| リジン（L）バッファ |
| 50ミリリットルコニカルチューブに以下を追加します。 |
| 0.4グラムのリジン |
| 1.2ミリリットルの0.2Mリン酸ナトリウム二塩基 |
| 8.0ミリリットル解剖（P）バッファ |
| 10.0ミリリットルの蒸留水 |
| リシンが完全に溶解するまで溶液を振る |
| 冷たいまで氷上に置いてください（前各解剖に新鮮にする） |
| 2％パラホルムアルデヒド-リジン-素酸（PLP）固定液 |
| 0.1グラムヨウ素酸ナトリウム |
| リジン（L）バッファの15.0ミリリットル |
| 8％のパラホルムアルデヒド5.0mlの |
| 過ヨウ素酸ナトリウムが完全に溶解するまで十分に溶液を振っ |
| 冷たいまで氷上に置いてください（前各解剖に新鮮にする） |
表2：必要なソリューションのためのレシピ。
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Discussion
この手順は、主に目を触角ディスクの単離およびその後の治療に焦点を当ててきたが、それは翼、平均棍、足や性器ディスク（ 図4）を単離および分析するために使用されることに適している。 （目を触角ではなく）これらのディスクを分離するためのプロトコルの唯一の必須修正は、粗い解剖（プロトコルのセクション2）の方法である。第一胸椎の脚（T1）のペアは、幼虫の前で見られると目を触角の分離のためのプロトコルに従うことによって回収することができる。しかし第二胸椎の脚（T2）ディスクはクチクラに取り付けられている。鉗子の別のペアは、動物の腹側キューティクルを握るために使用する必要がありながら、（上述のように）一対の鉗子口のフックを保持するために使用されるべきで、これらのディスクを単離するために（から幼虫約3分の1を握るようにしてください口のフック。幼虫は、単純にLARの残りの部分から離れて腹キューティクルを引き裂くことによってフィレットすることができますVA。 T2は脚がキューティクルに付着したままになります。第三の胸部（T3）の脚も、キューティクルに装着され、それ自体複合体の一部として翼と平均棍のディスクに取り付けられている。あなたは、この段階ではキューティクルからディスクコンプレックスとT2の足を分離するか、その後の固定/抗体インキュベーションステップの間に一緒にキューティクルディスク複合体を維持し、手順（セクション4）の微切開部分の間にディスクを隔離するために選択することができます。性器のディスクを回復するためには、鉗子の1対の中間部で幼虫を把握してから離れて中央部から開始し、幼虫の後端で終わる鉗子の他のペアで腹キューティクルを剥離するのが最善です。これは、鉗子が離れて、すべての余分な組織をクリアした後、P-200ピペットマンとそのエンドかみそりの刃で切断された黄色のチップを用いて固定液にちょうど性器ディスクを転送するために使用することをお勧めします。
この手順は、TISSに最適であるそのような成虫などの限られた厚みのUEとの抗体が使用されている場合最高の作品は、高い力価と特異性のものである。しかし、このような成体卵巣、精巣および脳など、ならびに低力価の抗体又は所望の「背景」の染色よりも与えるもので、より厚い組織にうまく動作するように適合させることができる。厚い組織を操作するとき、それは、最適な結果を単にパラホルムアルデヒドの濃度を増加させ、および/またはより長い時間PLP固定液中でインキュベートすることによって得られることが示唆される。切開した組織の適切な固定は、このプロトコルの成功のために必須であるので、それはまた、ホルムアルデヒドの濃度を増加させ、および/ または固定長さを増加させる効率をファロイジン（ 図1）で評価されることが示唆される。具体的には、細心の注意が組織内の細胞の輪郭および他の物理的なランドマークの「鋭さ」に支払われるべきである（ すなわち、morphogenetic畝間）。あなたの組織（特に厚いサンプル）適切に固定されていることを確認する別の方法は、8％のパラホルムアルデヒドおよび前各切開の新鮮なPLP溶液を調製することである。組織は短期間に解剖し、組織をできるだけ早く固定液中に転送された場合、最後に、切開の全体的な品質を向上させることができる。それは、15〜20分を超えない長く切開することが示唆された。短い持続時間解剖すると、組織保存の品質を向上させます。
このプロトコルは、抗体の広い範囲でうまく動作しますが、それはいくつかの抗体は、PLP固定液とうまく動作しないことは事実である。一悪名高い例は、ラフ（ろ）転写因子を認識する抗体である。ラフは、内で発現され、光受容体35の開発のサブセットの仕様のために必要とされる。抗Roの抗体ではなく、PLPで、最高の作品ではなく、パイプで- EGTA - 硫酸マグネシウム（PEM）Buffer 36。同様に、他の抗体は、さらに他の固定液中でインキュベートされた組織上で最適に動作することができる。これは、特に明記しない限り、PLP固定液が最初に試行されるべきである、と示唆されている。失敗した場合、代替の固定剤を発見するプロセスが開始する必要があります。
立ち向かうための一つの一般的な問題は、問題の抗体の使用濃度である。多くの場合には、興味のある組織中のタンパク質を検出するために特定の抗体を使用する最初の研究者であってもよい。作業濃度は、他の組織のために報告されているものから逸脱する可能性がある。これは、推奨濃度が最初に試されることをお勧めします。信号が見えない場合は、抗体の濃度を増加させます。推奨濃度が与える一方、その抗体を希釈する高いバックグラウンド染色が試されるべきである。抗体の中で作業濃度が変化することができる。アンチながら5：例えば、抗アイズ欠席（EYA）抗体1に希釈される500希釈：ELAV抗体があっても1で良好に動作します。 3000：いくつかの抗体は、さえまでダウン1と希釈することができる。また、この手順では、書かれたように、高い特異抗体を用いて最適に動作します。多くが経験しているようしかし、いくつかの抗体は、組織に非特異的に結合することができ、これは次善の画像を作成することができる。この状況は、多くの場合、固定成虫に添加される前に固定された胚または幼虫の死骸で希釈した抗体をインキュベートすることによって補正することができる。非特異的バックグラウンド染色のレベルに応じて、「予備吸収」の必要な長さを変えることができ、試験的に働いなければならない。これは、複数回再使用して抗体をするか、事前吸収のいくつかのラウンドを行うことにより、信号/雑音比を増加させることも可能である。
ディスクは出版物、および/またはプレゼンテーションで使用すべきかを決定する際に、それがアップ指向の頂端側に配向されたディスクを選択するのが最善です。病棟。また、折り畳まれていないディスクを使用することをお勧めします。これは目を触角の特に当てはまる。ディスクの腹側を折るする傾向があり、残念ながら、これを防ぐためにできることはほとんどものがある。一つの解決策は、これらがはるかに折り畳まれる傾向があるので、若いのディスクを分析することです。別のオプションは、あなたが完全に平らであるものを取得するまで、ちょうどディスクの多数を分析することです。アイ触角の全体形状は、幼虫が引き裂かれる速度によって影響され得る。一つはあまりにも速く離れて幼虫を引き出した場合は脳ディスク複合体が通過する穴が小さく、目を触角は折り畳まれ、および/または伸びが出てきます。これは、幼虫が穴が大きくなりますので、涙が開始されるまで、ゆっくりと引くのがベストです。その後、ゆっくりと脳アイ触角複合体を引っ張って続けることができます。あなたも、ゆっくりと引くことはできないことに注意してください。また、あなたが組織を引き裂くする速度は、他の組織の単離要因ではないことに注意。
ve_content "> ショウジョウバエのライフサイクルは3幼虫の段階で構成されています。重要な発生事象は、このように、それだけではなく（この手順の主な焦点である）第三の幼虫齢から組織を分離するために重要であるかもしれない、これらの各フェーズ1の間に行わだけでなく、第1および第2の両方の幼虫からだけでなく、齢。書かれたように、1つのマイナー例外を除いて、この手順は手順（セクション4）の微切開部分の間、それが鋭いタングステンことをお勧めします。第二齢ディスクを分離するために、使用することができ、ワイヤは、口フック、脳および唾液腺のような無関係な組織からのアイ触角を分離するために使用されるべきである。タングステン線が互いにT2 / T3脚、翼と平均棍ディスクとその上のキューティクルを分離するためにも使用することができそれは、タングステン線の一端（組織を分離するために使用される端部）は、沸騰硝酸ナトリウム浴中で加熱して先鋭化することを推奨され、他端は、ピン万力内に挿入することができる;番目あなたがより簡単にタングステン線を保持することができますです。残念ながら、それはあなたがスライドに全体が目を触角/脳/口フック複合体を配置し、カバーガラスでカバーすることが、したがって、それが推奨され、無傷の第一齢ディスクを単離することがかなり困難である。切開した組織の量は、従来のスライド上にディスク/脳/口フック複合体を取り付けに唾液腺と重なるキューティクルを除去するための鋭利なタングステンワイヤを使用することによって最小限に抑えることができる。それはそれはまだ脳と口のフックに装着した際37（図6A、クマーとモーセ、2001 D参照）第一齢目を触角を識別することは比較的容易である。他の成虫はキューティクルから分離され、閲覧するためのスライド上に配置する必要があります。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
私たちは、JPK、元原基の解剖手順を教えるためのドナルドレディとケビンモーセに感謝したいと思います。また、 図1（b）の性器ディスクと抗体については図2（a）、図3のためにブランドンWeasner、フライの汚れのためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターと発達研究ハイブリドーマバンクの目のディスクのボニーWeasnerに感謝します。 CMSは、国立衛生研究所（NIH）GCMSトレーニンググラント（T32-GM007757）、フランク·W·パトナム研究フェローシップ、そしてロバート·ブリッグス研究員からの奨学金によってサポートされています。 JPKは国立眼研究所からの助成金によってサポートされている（R01 EY014863）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, Cambridge Press. 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
