Een gelateraliseerde Geur Learning Model in pasgeboren ratten voor Prepareernaald Neural Circuits Underpinning Memory Formation

Summary

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Abstract

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Introduction

Reukzin is de primaire sensorische modaliteit in knaagdieren, zonder welke zij niet in staat zou zijn om succesvol te navigeren of te overleven in hun omgeving. Het is vooral van belang voor neonatale pups, die niet kan zien of horen tijdens de eerste postnatale week, om reuk gebruiken om hun moeder lokaliseren te voeden ^1. Hierdoor kan neonatale pups ratten worden geconditioneerd om geuren eenvoudige experimentele manipulaties voorkeur. Een verscheidenheid aan stimuli zijn gebruikt als de ongeconditioneerde stimulus (UCS) naar geconditioneerde responsen op nieuwe geuren (geconditioneerde stimulus, CS) bij pasgeborenen, waaronder het nesten milieu ^2,3, melk zogen ^4-6, aaien of aanrakingen ^7- induceren ^12, staart knijpen ^13, moeders speeksel ^13, milde voet shock ^14-18, en intracraniële hersenstimulatie ^19. Deze studie maakt gebruik van een gevestigde vroege geur voorkeur paradigma waarbij een geur, in dit geval pepermunt, is gecombineerd met tactiele stimulatie om een voorkeur voor pepermunt 24 uur later ^10,11,20 produceren. Deze geuren herinneringen zijn afhankelijk van intacte olfactorische circuits, voornamelijk met inbegrip van de olfactorische bollen (OB) ^21-23 en de voorste piriformis cortex (APC) ^24,25.

Experimenteel onderzoek van de vroege geur voorkeur leren hebben verdiept en verbreed ons begrip van de moleculaire en fysiologische onderbouwing van een zoogdier geheugen. Dit zoogdiermodel heeft verschillende voordelen bestuderen geheugenmechanismen. Ten eerste hebben de neurale bronnen van de UCS signaal geïdentificeerd. Verscheidene stimuli zoals hierboven vermeld stimuleren locus coeruleus noradrenaline afgifte ^26, die op zijn beurt activeert meerdere adrenoceptoren in de OB en aPC, waardoor cellulaire en fysiologische effecten die ondersteunen leren ^22,27,28. Tweede-geheugen ondersteunen mechanismen vinden plaats in goed gedefinieerde laminaire neurale structuren. Heteenvoud van de olfactorische circuits in neonatale ratten biedt onderzoekers met de ideale kader waarmee de ingewikkelde processen met betrekking tot de synaptische plasticiteit ontdekken. Olfactorische sensorische neuronen (OSN) in het reukepitheel project op mitralisklep / getuft cellen in de OB en deze mitralisklep / getuft cellen op hun beurt project ipsilateraal aan piriformis cortex (PC) via de laterale reukkanaal (LOT), onder andere structuren ^29. Zowel de OSN synapsen in de OB ^30,31 en de LOT synapsen ^24,25 in aPC zijn geïdentificeerd als kritische loci voor synaptische veranderingen die ondersteunen het leren en het geheugen. Ten derde, in een vroege leeftijd bij ratten, olfactorische ingangen kunnen gemakkelijk worden gelateraliseerde. Elke aPC heeft toegang tot bilaterale geur van informatie via het voorste commissuur zodra deze witte stof wordt volledig gevormd op postnatale dag 12 (PD12) ^32. Voordat PD 12, kan geur-ingang worden geïsoleerd om OB en APC ipisilateral door enkele naris occlusie ^{24,25,31,33,34 <}/ Sup>. Single naris occlusie maakt de geur vorming van het geheugen van de open naris, en voorkomt dat hetzelfde geheugen van de afgesloten naris voor PD 12 ^33. Geur geheugen is geïsoleerd aan de ipsilaterale hemisfeer met inbegrip van zowel OB en APC. Daarom kan elke pup rat zijn eigen controle voor het leren en de basis vormt fysiologie zijn.

In de huidige studie wordt de gelateraliseerde vroege geur voorkeur leren protocol geïntroduceerd. Deze methode dient als een krachtig instrument voor het bestuderen van de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de geur leren door middel van een intra-dierlijke controle ^24,25,31, waardoor zowel het aantal benodigde dieren en het grote variatie verminderen. Naris occlusie omkeerbaar, dat het vet of neus plug kan worden aangebracht en verwijderd met minimale stress of schade aan het dier. Hier, eerste, gedetailleerde procedures van vroege geur voorkeur training en testen worden beschreven, met een focus op de gelateraliseerde protocol met behulp van enkele naris occlusie met een nose stekker. Vervolgens resultaten worden om de effectiviteit van afzonderlijke Naris occlusie isoleren geur invoer en produceert gelateralizeerde geur geheugen tonen. Tot slot, de mogelijkheden van het gebruik van deze gelateraliseerde leermodel om fysiologische veranderingen in het olfactorische systeem dat zowel het genereren van leren en ondersteuning van het geheugen expressie te bestuderen worden besproken.

Protocol

Sprague Dawley ratten (Charles River) pups van beide geslachten worden gebruikt. Nesten worden geruimd om 12 op PD1 (geboorte zijnde PD0). De dammen worden onderhouden op een 12 uur licht / donker cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Experimentele procedures zijn goedgekeurd door Institutional Animal Care Committee Memorial University. 1 Nose Plug Bouw OPMERKING:. Deze procedure werd aangepast en gewijzigd van Cummings et al</em…

Representative Results

Hier geven we een aantal van de eerder vastgestelde resultaten 24 de doeltreffendheid van de Naris occlusie isoleren geur ingang en leren een halfrond en de reversibiliteit van deze werkwijze tonen. Single naris occlusie tijdens de vroege geur voorkeur opleiding leidt tot een gelateraliseerde geur geheugen 24. Het geheugen is beperkt tot de gespaarde naris (Figuur 3). Wanneer pups worden getest op geur voorkeur met dezelfde naris afgesloten als tijdens …

Discussion

De gelateraliseerde geur leren en geheugen model in jonge ratten binnen een kritisch tijdsvenster werd voor het eerst vastgesteld door Hall en collega's. In een reeks van studies ^33,34,36, ze toonden aan dat een geur voorkeur geheugen kon worden gelateraliseerde door geur + melk paringen om een naris bij PD 6 bij jonge ratten. Voorkeur geheugen was robuust als dezelfde naris was open tijdens de training en het testen, maar niet waargenomen wanneer de verstopte naris was gedeblokkeerd en getest. Echter, op…

Materials

Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non radiopaque, Non toxic
3-0 silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non absorbant
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly,  purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brand should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20x20x5cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30x20x18cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A