Um Modelo de Aprendizagem lateralizados Odor em ratos recém-nascidos para Dissecando Formação Neural dos circuitos Consolidação da Memória

Summary

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Abstract

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Introduction

O olfato é a modalidade sensorial primário em roedores, sem o que não seria capaz de navegar ou sobreviver em seu ambiente com sucesso. É especialmente importante para os filhotes recém-nascidos, que nem podem ver, nem ouvir, durante a primeira semana pós-natal, para usar o olfato para localizar a sua mãe para alimentar ^1. Como resultado, os filhotes de ratos recém-nascidos pode ser condicionado a preferir odores com manipulações experimentais simples. Uma variedade de estímulos têm sido usados ​​como estímulo incondicionado (UCS) para induzir respostas condicionadas a novos odores (estímulo condicionado, CS) em recém-nascidos, incluindo o ambiente de nidificação ^2,3, sugando leite ^4-6, acariciando ou estimulação tátil ^{7 12, 13} de aperto da cauda, ​​saliva materna ^{13, 14-18} leve choque nas patas, intracraniana e a estimulação do cérebro ^19. O presente estudo emprega um odor precoce preferência paradigma bem estabelecido, em que o odor, neste caso, de hortelã-pimenta, is combinados com a estimulação táctil de modo a produzir uma preferência para hortelã-pimenta 24 horas mais tarde ^10,11,20. Estas memórias odores são dependentes de circuitos olfativa intacta, incluindo principalmente o bulbo olfatório (OB) ^21-23 eo córtex piriforme anterior (APC) ^24,25.

Investigações experimentais do início do aprendizado preferência odor aprofundaram e ampliaram nossa compreensão das bases moleculares e fisiológicos de uma memória dos mamíferos. Este modelo de mamíferos tem várias vantagens em estudar mecanismos de memória. Em primeiro lugar, as fontes neurais do sinal UCS foram identificados. Vários estímulos, como mencionado acima estimular lócus coeruleus liberação de noradrenalina ^26, que por sua vez ativa vários receptores adrenérgicos na OB e APC, causando efeitos celulares e fisiológicos que sustentam o aprendizado ^22,27,28. Em segundo lugar, os mecanismos de memória de apoio ter lugar em estruturas neurais laminares bem definidas. Asimplicidade do circuito olfativo em ratos recém-nascidos fornece aos pesquisadores do quadro ideal com o qual a desvendar os intrincados processos relacionados com a plasticidade sináptica. Neurônios olfativos sensoriais (OSN) no projeto epitélio olfativo Onto mitral / células tufados no OB e estes mitral / células tufados, por sua vez projeto ipsi para córtex piriforme (PC) via lateral trato olfatório (LOT), entre outras estruturas ^29. Ambas as sinapses OSN no OB ^30,31 ea LOT sinapses ^24,25 na APC foram identificados como loci crítico para mudanças sinápticas que apoiar a aprendizagem ea memória. Em terceiro lugar, em uma idade precoce em ratos, insumos olfativos podem ser facilmente lateralizada. Cada A APC tem acesso à informação odor bilateral através da comissura anterior uma vez que esta substância branca está completamente formado no pós-natal dia 12 (PD12) ^32. Antes PD 12, entrada de odor pode ser isolado para ipisilateral OB e APC através único oclusão naris ^{24,25,31,33,34 <}/ Sup>. Oclusão naris Único permite a formação de memória odor do naris aberto, e impede a mesma memória das narinas ocluídas anteriores para PD 12 ^33. Memória Odor é isolado para o hemisfério ipsilateral incluindo tanto OB e APC. Portanto, cada filhote de rato pode ser seu próprio controle para o aprendizado e subjacente a fisiologia.

No presente estudo, o odor cedo protocolo aprendizagem preferência lateralizada é introduzido. Este método serve como uma ferramenta poderosa para o estudo dos mecanismos neurais subjacentes aprendizagem odor, proporcionando um controlo intra-animais ^24,25,31, reduzindo assim tanto o número de animais necessários e a variação geral. Oclusão naris é reversível em que o bujão de gordura ou nariz pode ser aplicado e removido com o stress ou dano para o animal mínimo. Aqui, em primeiro lugar, os procedimentos detalhados de treinamento preferência odor cedo e testes são descritos, com foco no protocolo lateralizado usando oclusão naris único com um nsae tampão. Em seguida, os resultados são apresentados para demonstrar a eficácia de oclusão naris único no isolamento de entrada odor e produzindo odor lateralizado memória. Por fim, são discutidas as potencialidades da utilização deste modelo de aprendizagem lateralizado para estudar mudanças fisiológicas no sistema olfativo que ambos geram aprendizado e memória apoio expressão.

Protocol

Sprague Dawley (Charles River) filhotes de ambos os sexos são usados. As ninhadas são abatidos para 12 no PD1 (nascimento sendo PD0). Os reservatórios são mantidos num ciclo claro / escuro de 12 horas de luz, com acesso ad libitum a comida e água. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional da Universidade Memorial. 1. Nose plug Construção NOTA:. Este procedimento foi adaptado e modificado a partir …

Representative Results

Aqui vamos rever alguns dos resultados previamente estabelecidos 24 para demonstrar a eficácia da oclusão naris em isolar entrada odor e aprender a um hemisfério, ea reversibilidade do método. Oclusão Único naris durante o treinamento preferência odor precoce leva a uma memória odor lateralizado 24. A memória é confinado ao naris poupados (Figura 3). Quando os filhotes são testados quanto à preferência de odor com a mesma naris ocluído dur…

Discussion

O modelo de aprendizagem e memória odor lateralizado em filhotes de rato dentro de uma janela de tempo crítico foi estabelecido pela primeira vez por Hall e colegas. Em uma série de estudos ^33,34,36, eles mostraram que uma memória preferência odor poderia ser lateralizado por odores + leite pares para um naris em PD 6 em filhotes de ratos. Memória preferência era robusto quando o mesmo naris estava aberta durante o treinamento e teste, mas não observada quando o naris oclusa foi desbloqueado e testado…

Materials

Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non radiopaque, Non toxic
3-0 silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non absorbant
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly,  purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brand should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20x20x5cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30x20x18cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A