En lateraliseret Lugt Learning Model hos neonatale rotter til Dissecting Neural Circuitry Underbygning hukommelsesdannelse

Summary

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Abstract

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Introduction

Lugtesansen er den primære sensoriske modalitet hos gnavere, uden hvilken de ikke ville være i stand til at navigere eller overleve i deres miljø. Det er især kritisk for neonatale hvalpe, som hverken kan se eller høre under den første postnatale uge, for at bruge lugtesansen for at lokalisere deres mor til foder ^1. Som et resultat, kan neonatale rotteunger konditioneres at foretrække lugte med enkle eksperimentelle manipulationer. En række af stimuli er blevet anvendt som den ubetinget stimulus (UCS) for at inducere betingede reaktioner på nye lugte (betinget stimulus, CS) hos nyfødte, herunder rugende miljø ^2,3, mælk diegivning ^4-6, strøg eller taktil stimulation ^{7- 12} hale knivspids ¹³ moderens spyt ¹³ mild stød i foden ^{14 til 18,} og intrakranielle hjernestimulation ^19. Nærværende undersøgelse anvender en veletableret tidlig lugt præference paradigme, hvor en lugt, i dette tilfælde pebermynte, jegs kombineret med taktil stimulation for at producere en præference for pebermynte 24 timer senere ^10,11,20. Disse lugte erindringer er afhængige af intakt olfaktoriske kredsløb, primært herunder olfaktoriske pærer (OB) ^21-23, og den forreste piriform cortex (APC) ^24,25.

Eksperimentelle undersøgelser af den tidlige lugt præference læring har uddybet og udvidet vores forståelse af de molekylære og fysiologiske fundament for et pattedyr hukommelse. Denne pattedyr model har flere fordele i at studere hukommelse mekanismer. Først er der konstateret neurale kilder UCS signalet. Forskellige stimuli som nævnt ovenfor stimulerer locus coeruleus noradrenalinfrigivelse ^26, som igen aktiverer flere adrenoceptorer i OB og aPC, forårsager cellulære og fysiologiske virkninger, der understøtter lære ^22,27,28. For det andet, memory-støtte mekanismer foregår i veldefinerede laminare neurale strukturer. Denenkelhed af det olfaktoriske kredsløb hos neonatale rotter giver forskere med den ideelle ramme, som at afdække de indviklede processer relateret til synaptisk plasticitet. Olfaktoriske sensoriske neuroner (OSN) i lugtepithelet projekt på mitral / tuftede celler i OB, og disse mitral / tuftede celler i sving projekt ipsilaterally til piriform cortex (PC) via den laterale olfaktoriske tarmkanalen (parti), blandt andre strukturer ^29. Både OSN synapser i OB ^30,31 og Lot synapser ^24,25 i aPC er blevet identificeret som kritiske loci, for synaptiske ændringer, der understøtter indlæring og hukommelse. For det tredje, i en tidlig alder hos rotter, lugtesansen indgange kan let lateraliseret. Hver aPC'et har adgang til bilateral lugt information via forreste commissure når denne hvide substans er fuldt dannet ved postnatal dag 12 (PD12) ^32. Før PD 12 kan lugt input isoleres til ipisilateral OB og APC gennem enkelt Naris okklusion ^{24,25,31,33,34 <}/ Sup>. Enkelt Naris okklusion tillader lugt hukommelse dannelse fra det åbne Naris, og forhindrer den samme hukommelse fra den okkluderede Naris før PD 12 ^33. Lugt hukommelse er isoleret til den ipsilaterale hemisfære herunder både OB og APC. Derfor kan hver rotteafkommets være sin egen kontrol for at lære og understøtte fysiologi.

I den foreliggende undersøgelse, introduceres lateraliseret tidlig lugt præference læring protokol. Denne metode tjener som et effektivt redskab til at studere neurale mekanismer der ligger til grund lugt læring ved at give en intra-animalsk kontrol ^24,25,31, og derved reducere både antallet af dyr, der kræves, og den generelle variation. Naris okklusion er reversibel ved, at fedt eller næse stik kan anvendes og fjernes med minimal stress eller skade på dyret. Her først er detaljerede procedurer for tidlig lugt præference træning og test, der er beskrevet, med fokus på den lateraliseret protokol anvendes enkelt Naris okklusion med en nose stik. Så resultaterne præsenteres for at demonstrere effektiviteten af ​​en enkelt Naris okklusion ved isolering lugt input og producerer lateraliseret lugt hukommelse. Endelig er potentialerne i at bruge denne lateraliseret læring model til at studere fysiologiske ændringer i det olfaktoriske system, som både genererer læring og støtte hukommelse udtryk diskuteret.

Protocol

Sprague Dawley rotte (Charles River) hvalpe af begge køn bliver brugt. Kuld aflives til 12 på PD1 (fødsel bliver PD0). De dæmninger holdes på en 12 timers lys / mørke-cyklus med ad libitum adgang til foder og vand. Eksperimentelle procedurer er blevet godkendt af Memorial University Institutional Animal Care udvalget. 1. Næse Stik konstruktion BEMÆRK:. Denne procedure blev tilpasset og modificeret fra Cummings et al (1997) 35…

Representative Results

Her har vi gennemgå nogle af de tidligere fastsatte resultater 24 for at demonstrere effektiviteten af Naris okklusion i isolere lugt input og lære at én halvkugle og reversibilitet denne metode. Enkelt Naris okklusion i den tidlige lugt præference uddannelse fører til en lateraliseret lugt hukommelse 24. Hukommelsen er begrænset til det sparet Naris (Figur 3). Når hvalpene er testet for lugt præference med samme Naris okkluderet som under træn…

Discussion

Den lateraliseret lugt indlæring og hukommelse model hos rotteunger inden et kritisk tidspunkt vindue blev først etableret af Hall og kolleger. I en række undersøgelser ^33,34,36, viste de, at en lugt præference hukommelse kunne lateraliseret af lugt + mælk fodboldmesterskaber til én Naris på PD 6 i rotteunger. Preference hukommelse var robust, når det samme Naris var åben under træning og test, men ikke observeret, når den okkluderede Naris var blokeringen og testet. Men ved PD 12, når forreste k…

Materials

Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non radiopaque, Non toxic
3-0 silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non absorbant
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly,  purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brand should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20x20x5cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30x20x18cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A