세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

요약

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

초록

이주 할 수있는 능력은 다양한 세포 유형의 특징이며 배아 발생, 상처 치유, 및 면역 반응을 포함한 여러 생리 과정에서 중요한 역할을한다. 그러나, 세포 이동은 또한 확산 전이성을 시작하는 일차 종양으로부터 분리하는이 암세포를 활성화 암에서 중요한 메커니즘이다. 과거 내의 다양한 세포 이동 분석법은 다른 세포 유형의 이동성 동작을 분석하기 위해 개발되어왔다. 세포 locomotory 문제가 현저하게 이차원 (2D) 사이의 차이 및 3 차원 (3D) 환경 그것은 3D 환경 내에 포함 된 세포의 이동의 분석은 더 중요한 세포 이동을 수율 것이라고 가정 할 수 있으므로 데이터. 기재된 3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석의 장점은 세포 외 매트릭스의 주요 구성 요소를 나타내는 콜라겐 섬유의 생리적 3D 네트워크 내에 내장된다는 점이다. 으로 인해시간 경과 비디오 현미경 리얼 셀 마이그레이션 프로 이동성 인자 또는 저해제에 응답하여 여러 이주 파라미터뿐만 아니라 변형의 결정을 허용 측정된다. 다양한 세포 유형의 세포 및 종양 세포를 림프구 / 백혈구를 포함한,이 기술을 이용하여 줄기를 분석 할 수있다. 마찬가지로, 또한, 셀의 클러스터 또는 타원체가 콜라겐으로 격자 셀 클러스터 / 타원체부터 단일 세포의 이주의 분석 콜라겐 매트릭스 수반 내에 내장 될 수있다. 우리는 3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 생리와 같은 3D 환경에서 세포의 이동을 분석 할 수있는 다양한 방법이라고 결론 지었다.

서론

세포 융합 (개요는 ^{1, 2 참조)} 세포의 이동이 배아 발달, 상처 치유 및 면역 반응 (검토를 위해 ^{3 참조)을} 포함하여 생리 학적 과정의 과다에 참여하는 다른 생물학적 현상처럼. 그러나, 마이그레이션 할 수있는 기능은 종양 세포가 (검토를 위해 ^{3,4 참조)} 전이하기위한 전제 조건이기도하다.

세포 이동은, 복잡하고 다양한 리간드 (예, 사이토 카인, 케모카인, 성장 인자, 호르몬, 세포 외 매트릭스 성분) 수용체 (예를 들면, 수용체 티로신 키나제에 의해 개시 여러 신호 전달 경로의 작용에 의해 지시된다 아직 완전히 이해 과정 궁극적 있도록 지연 및 초점 접착 단지의 재 조립과 함께 액틴 세포 골격의 수반의 재구성을 일으키는 케모카인 수용체, 인테그린)의 상호 작용 ^{5 6 신호} 인테그린은 매개.

시험 관내 여러 생체 세포 이동 분석에서 세포의 이동을 분석하는 분석 실험 ^8-10, 입체감을 (치유 보이든 챔버 / 트랜스 웰 어 세이 ^7, 내찰 분석 / 상처를 포함한 과거 수십 년 동안 개....

프로토콜

마이그레이션 챔버의 1 준비

1. 혼합물까지 혼합하고 열이 녹아 : 파라핀 왁스 / 석유 젤리 (1 일)을 준비합니다. 페인트 브러시를 사용하고 파라핀 왁스 / 바셀린의 2-3 층 그릴 (1 : 1)도 1B-1D에 따라 유리 슬라이드의 중간에 섞는다.
   참고 : 우리는 일반적으로 유리 슬라이드를 사용하는 (76 X 26 X 1.0 ~ 1.5 mm (W / D / H))
2. 그리는 동안 응고를 방지하기 위해 유리 슬라이드에 급속히 용융 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스를 적용. 파라핀 왁스 / 바셀린 층은 길이가 약 2-2.5 cm, 폭 0.3 ~ 0.5 cm이다 확인. 파라핀 왁스 / 바셀린 층의 두께는 약 0.1-0.15 cm이어야한다.
3. 응고 된 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스에 커버 슬립을 추가하고 2-3 층 왁스 / 석유 젤리 믹스를 파라핀 (그림 1E, 1F)로 밀봉. 일반적인 세​​포의 이동 실험에 4-8 마이그레이션 챔버를 사용합니다. 장소 마이그레이션 챔버 전랙 위쪽 위치에 n.

콜라겐 서스펜션 셀 믹스의 2 준비

1. 수확 (예, 0.25 % 트립신 / EDTA)와 관심....

결과

시간 경과 비디오 - 현미경 및 컴퓨터 보조 셀 추적과 함께 사용되는 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 모두 인구 기반 파라미터 (예 locomotory 활성을 의미한다)을 포함하는 다양한 세포 이동 파라미터 및 단일 셀 기반 파라미터들의 결정을 허용 (예를 들어, 활성 이동, 속도, 거리의 시간은 마이그레이션). 얻어진 세포 트래킹 데이터 세트, 데이터 처리 및 데이터 프리젠 테이션의 예가도 2에 나타내었다. 데이터 파일을 트래킹 셀이 테이블 (도 2A)를 닮았다. 세포 이동 실험 당 30 세포를 추적함으로써 각 열은 하나의 추적 셀을 의미합니다. 행은 셀이 이동 여부를이 시점 사이의 여부 정보가 포함되어 있습니다. "화소"의 셀 거리를 나타내는 "수치"의 합이 시간 지점 사이 이동 한,이 세포가 이주했다 전체 거리이다. 이는 AC 곱하여"μm의"로 "픽셀"을 변환하는 orrection 요인. 보다 적은 25 μm의 이주 세포.......

토론

마이그레이션 할 수있는 능력은 종양 세포 ^4의 특징이다. 기본 종양에서 분리하고 거의 모든 암 환자의 사망의 주요 원인이되는 보조 병변을 배정 할 수 없습니다 주위의 결합 조직 종양 세포를 통해 마이그레이션 할 수있는 기능없이. 이 때문에 관계의 많은 연구는 암 세포의 이동에 초점을 맞추고있다. 이 연구의 목적은 효율적으로함으로써 손상 또는 전이 형성을 늦추고, 종양 세포의 이동을 차단하는 신규 한 표적 분자 및 목표 경로의 식별이다. 삼중 음성 유방암 환자에서 향상된 재발 생존과 관련되어 생체 내 ³⁶ 시험 관내 및 유방암 세포의 확산 전이를 억제하는 것으로 도시되고있다 β-차단제, 수도 등의 노력 예 암세포 ^37. 우리는 최근에 보여준 그는 자발적에서 파생 된 하이브리드 세포,인간 유방 상피 세포주 및 인간 유방암 세포주 아니지만 연령 셀 사이의 OU 융합 이벤트는, 증가 된 이동성 활동 ²⁶ 케모.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Leica DM IL 도립 현미경	Leica, Wetzlar, 독일
현미경 스테이지 히터	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, 독일
JVC C1431 비디오 카메라	JVC, Bad Vilbel, 독일
Axis 241Q 비디오 서버	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	애플 매킨토시
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleiß heim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
바셀린	현지 약국
Purecol (액상 콜라겐)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		함유 소 콜라겐 2.9 - 3.3 mg/ml (95% 콜라겐 I형, 5% 콜라겐 IV형)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% 중탄산나트륨 용액	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	CHCl3에서 먼저 용해하고 사용 직전에 DMSO에서 재구성

합니다.