Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

Summary

La migration des cellules est un phénomène biologique qui est impliquée dans une grande variété de physiologiques, telles que la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires, et des processus physiopathologiques, comme le cancer. La détermination de la migration de la matrice 3D-collagène est un outil polyvalent pour analyser les propriétés de migration de différents types de cellules à l'intérieur dans un environnement physiologique analogue à 3D.

Abstract

La capacité de migrer est une caractéristique de divers types de cellules et joue un rôle crucial dans plusieurs processus physiologiques, y compris le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, et les réponses immunitaires. Cependant, la migration cellulaire est également un mécanisme clé dans l'activation de ces cancers des cellules cancéreuses à se détacher de la tumeur primaire pour commencer la dissémination métastatique. Dans les dernières années, différents essais de migration cellulaire ont été développées pour analyser le comportement migratoire des différents types de cellules. Parce que le comportement locomoteur des cellules diffère nettement entre une à deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) l'environnement, il peut être supposé que l'analyse de la migration des cellules qui sont incorporées dans un environnement 3D donnerait à la migration cellulaire plus importante données. L'avantage de l'essai décrit à la migration de la matrice de collagène 3D est que les cellules sont incorporées dans un réseau 3D physiologique des fibres de collagène qui représentent la composante majeure de la matrice extracellulaire. Grâce àtime-lapse microscopie vidéo migration de cellules réelles est mesurée permettant la détermination de plusieurs paramètres de migration ainsi que leurs modifications en réponse à des facteurs pro-migratoires ou des inhibiteurs. Divers types de cellules peuvent être analysées en utilisant cette technique, y compris les lymphocytes / leucocytes, des cellules souches et des cellules tumorales. De même, aussi des amas de cellules ou sphéroïdes pourraient être intégrés dans le concomitante de matrice de collagène avec l'analyse de l'émigration des cellules individuelles de l'amas de cellules / sphéroïde dans le réseau de collagène. Nous concluons que le dosage de migration 3D de la matrice de collagène est un procédé polyvalent pour analyser la migration des cellules au sein d'un environnement 3D physiologique analogue.

Introduction

Comme la fusion cellulaire (pour un aperçu, voir ^1,2) la migration cellulaire est un autre phénomène biologique qui est impliqué dans une multitude de processus physiologiques tels que le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires (pour revue, voir ^3). Cependant, la capacité de migrer est également une condition préalable pour les cellules tumorales à métastaser (pour revue, voir ^3,4).

La migration cellulaire est un complexe, pas procédé encore entièrement compris qui est dirigée par l'interaction de plusieurs voies de transduction du signal initié par divers ligand (par exemple, des cytokines, des chimiokines, des facteurs de croissance, les hormones, les composants de la matrice extracellulaire) récepteur (par exemple, les kinases de tyrosine du récepteur, récepteurs de chimiokines, intégrines) ⁵ interactions provoquant finalement la réorganisation du cytosquelette d'actine concomitante ment et le remontage des complexes d'adhésion focale et l'intégrine-médiation de signalisation ^6.

<p class = "jove_content"> Pour analyser la migration des cellules de plusieurs in vitro et in vivo de la migration des cellules ont été développés au cours des dernières décennies, y compris le test Boyden chambre / transwell ^7, zéro dosage / cicatrisation dosage ^8-10, en trois dimensions ( 3D) matrice de collagène migration dosage ¹¹ ainsi que intravital imagerie / microscopie (pour revue, voir ^12). Chacun de ces essais de migration cellulaire a des avantages et des inconvénients, par exemple, concernant les coûts et les besoins de l'équipement, de la manutention ou de la fiabilité des données obtenues.

Tant la chambre / test transwell Boyden et le / la cicatrisation dosage dosage de zéro sont, à faible coût et facile dosages bien développés pour mesurer la migration cellulaire in vitro ^7-10. Dans la chambre de Boyden / cellules transwell d'analyse sont ensemencées sur un insert contenant des pores (environ 8 m de diamètre) – le compartiment supérieur ⁷ soi-disant. En option, l'insert peut être revêtu de m extracellulaireAtrix composants, par exemple, la fibronectine, le collagène, etc, afin d'imiter un environnement plus physiologique. De même, les cellules endotheliales peuvent être cultivées sur le dessus de l'insert, imitant ainsi une barrière de cellules endotheliales ^13. Les cellules qui sont passées à travers les pores pendant un intervalle de temps défini dans le compartiment inférieur hébergeant médias et les suppléments, tels que des facteurs de croissance et des chimiokines, sont utilisées comme une sortie de lecture quantifier la migration des cellules (ou extravasation).

Dans le test de rayure / cellules d'essai de cicatrisation sont ensemencées dans des plaques et sont cultivées jusqu'à confluence ^10. En fonction des plaques de montage expérimental peut être pré-revêtu avec des composants de la matrice extracellulaire, comme la fibronectine. Après avoir créé une égratignure / plaies par grattage des cellules individuelles de monocouches de cellules de chaque côté de la rayure / blessure peut migrer dans l'espace, remplissant ainsi / guérissant ^10. La distance entre les deux côtés de la rayure / blessures est déterminéeen fonction du temps et est utilisé comme une sortie de lecture pour l'activité de migration des cellules ^10. Cependant, faire la distinction entre la prolifération cellulaire (ce qui pourrait également entraîner de remplissage / la guérison de la rayure / blessure) et la migration cellulaire, il est recommandé de combiner le dosage avec time-lapse microscopie vidéo et une seule cellule de suivi ^10.

Toutefois, la chambre de Boyden / test transwell et zéro dosage / cicatrisation dosage, sont assez imparfaite concernant un environnement cellulaire physiologique comme. Dans la chambre de Boyden / cellules d'essai transwell ont à migrer à travers un pore plastique, tandis que dans le test de zéro / de cicatrisation des cellules d'essai sont ensemencées sur une plaque de matière plastique pré-revêtu à deux dimensions. De même, il est bien connu que le comportement migratoire diffère sensiblement entre un environnement en deux dimensions et 3D ^3. Par exemple, les adhérences tridimensionnel matrice de fibroblastes diffèrent des adhésions focales et sur deux fibrillaires caractérisésubstrats de dimension de leur contenu et de α5β1 intégrine avß3, la paxilline, d'autres composants du cytosquelette, et phosphorylation de la tyrosine kinase d'adhérence focale ^14. De même, les cellules intégrées dans un environnement 3D s'affichent également un comportement migratoire modifié ^15. Ainsi, pour analyser la migration des cellules avec plus de précision un dosage de migration est recommandé permettant de mesurer la migration de cellules individuelles au sein d'un milieu physiologique ou physiologique analogue à 3D.

Intravitale imagerie / microscopie est l'étalon-or pour mesurer la migration des cellules dans un contexte physiologique 3D. Cela ne fait pas partie des interactions matrice de cellules extracellulaires, mais aussi aux interactions entre les différents types de cellules, comme les cellules tumorales et les cellules endothéliales lors de l'extravasation ¹⁶ ou le trafic des lymphocytes à l'intérieur du ganglion lymphatique ^17, qui, à ce jour, est possible grâce à l'amélioration des techniques de microscopie par fluorescence, tels que le 2-photonmicroscopie confocale à balayage laser, l'utilisation de colorants fluorescents vitaux et les souches de souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dérivées ^12,16,17. En outre, l'imagerie intravitale / microscopie peut être combiné avec le suivi de la cellule manuelle et automatique ^18. Toutefois, en raison de la nécessité d'un 2-photon microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les animaux (et les modèles animaux transgéniques appropriés) intravitale imagerie / microscopie est une technique plutôt de coûteux.

Pour surmonter les limitations de la chambre / essai transwell Boyden et l'essai de cicatrisation dosage zéro / de la plaie et à analyser la migration de différents types de cellules dans un environnement 3D la détermination de la migration de la matrice de collagène 3D est développé ^11,19. De ce fait, la migration des cellules sont incorporées dans un réseau de fibres de collagène en 3D, qui ressemble plus à la situation in vivo. Conjointement, en raison de time-lapse microscopie vidéo migration de cellules réelles est mesurée permettant la déternation de plusieurs paramètres de migration ainsi que leurs modifications en réponse à des facteurs pro-migratoires ou des inhibiteurs. Divers types de cellules peuvent être analysées en utilisant cette technique, y compris les lymphocytes et les leucocytes ^11,20 souches hématopoïétiques, des cellules progénitrices / ^{21 à 24,} et les cellules tumorales ^5,25-29. En plus des cellules seule cellule également grappes ou sphéroïdes pourraient être intégrés dans le concomitante de matrice de collagène avec l'analyse de l'émigration des cellules individuelles de l'amas de cellules / sphéroïde dans le réseau de collagène ^30,31.

Ce protocole donne un aperçu d'une technique simple, mais puissant pour analyser le comportement migratoire des différents types de cellules dans un environnement 3D – une méthode in vitro donnant des résultats qui sont proches de la situation in vivo.

Protocol

1 Préparation de la migration Chambers Préparer une gelée de paraffine / pétrole (1: 1) mélanger et chauffer jusqu'à ce que le mélange soit fondu. Utilisation d'un pinceau et tirer 2-3 couches de la gelée de paraffine / éther de pétrole (1: 1) mélanger dans le milieu de la lame de verre, conformément aux figures 1B-1D. NOTE: Nous utilisons des lames de verre communes (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (L / P / H)) Appliquer le mélange de gelée de paraffine / pétrole…

Representative Results

La détermination de la migration matrice 3D-collagène utilisé combiné avec time-lapse vidéo-microscopie et le suivi de la cellule assistée par ordinateur permet la détermination des différents paramètres de la migration des cellules, y compris les deux paramètres sur la population (par exemple, signifier activité locomotrice) et les paramètres à base de cellules individuelles (par exemple, le temps de déplacement actif, la vitesse, la distance migré). Un exemple des ensembles de données…

Discussion

La capacité de migrer est une caractéristique des cellules tumorales ^4. Sans la capacité de se détacher de la tumeur primaire et la migration des cellules tumorales à travers les tissus conjonctifs environnants ne sera pas capable de semer des lésions secondaires, qui sont la cause principale de la mort de presque tous les patients atteints de cancer. En raison de cette relation de nombreuses études se concentrent sur la migration des cellules cancéreuses. Le but de ces études est l'identificatio…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petrolatum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% Sodium Bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use