Анализ миграции клеток в трехмерном коллагеновой матрице

Summary

Миграция клеток является биологическим феноменом, который участвует в многочисленных физиологических, таких как заживление ран и иммунных реакций, и патофизиологических процессов, как рак. 3D-коллагеновый матрикс анализа миграции является универсальным инструментом для анализа миграционных свойств различных типов клеток в в 3D физиологическая-среде.

Abstract

Способность переносить является отличительным признаком различных типов клеток и играет важную роль в нескольких физиологических процессов, в том числе эмбрионального развития, заживления ран, и иммунного ответа. Тем не менее, миграция клеток также является ключевым механизмом в рака позволяет эти раковые клетки отделяются от первичной опухоли, чтобы начать метастазирование. В течение последних лет различные анализы миграцию клеток были разработаны для анализа миграционного поведения различных типов клеток. Поскольку двигательные поведение клеток заметно отличается между двумерной (2D) и трехмерной (3D) окружающей среды, можно предположить, что анализ миграции клеток, внедренных в 3D-среде даст более существенный миграцию клеток Данные. Преимущество описанного 3D коллагеновой матрицы анализа миграции является то, что клетки встроены в физиологическом 3D сети коллагеновых волокон, представляющих основной компонент внеклеточной матрицы. Благодаряпокадровой видео микроскопии миграции клеток в реальном измеряется позволяет определить несколько параметров миграции, а также их изменения в ответ на про-миграционных факторов или ингибиторов. Различные типы клеток могут быть проанализированы с помощью этой техники, в том числе лимфоцитов / лейкоцитов, стволовые клетки и раковые клетки. Точно так же, также кластеры клеток или сфероидов может быть встроен в коллагеновой матрицы, одновременно с анализом эмиграции отдельных клеток от клеток кластера / сфероида в коллагена решетки. Мы пришли к выводу, что 3D коллагеновый матрикс анализа миграции является универсальным методом для анализа миграции клеток в пределах физиологической, как 3D-среде.

Introduction

Как слияния клеток (краткий обзор см ^1,2) миграция клеток еще один биологический феномен, который участвует в многочисленных физиологических процессах, включая эмбриональное развитие, заживление ран и иммунных реакций (для обзора см ^3). Тем не менее, способность к миграции также является необходимым условием для опухолевые клетки к метастазированию (для обзора посмотреть ^3,4).

Миграция клеток является сложным, еще не полностью изучены процесс, который направлен на взаимодействие нескольких путей передачи сигналов по инициативе различных лиганда (например, цитокины, хемокины, факторы роста, гормоны, компоненты внеклеточного матрикса) рецепторов (например, рецептор тирозинкиназы, рецепторы хемокинов, интегрины) взаимодействий ^5, в конечном счете, вызывающие реорганизацию цитоскелета одновременно с де- и повторной сборки фокальной адгезии комплексов и интегрином-опосредованной сигнализации ^6.

<p clasс = "jove_content"> Для анализа клеточной миграции несколько в пробирке и в естественных условиях миграции клеток анализов были разработаны в последние десятилетия, в том числе Бойден камера / Transwell анализа ^7, царапины анализ / заживления ран анализа ^8-10, трехмерная ( 3D) коллагеновой матрицы миграции анализ ^11, а также прижизненной визуализации / микроскопии (обзор см ^12). Каждый из этих миграции клеток анализов имеет плюсы и минусы, например, в отношении расходов и необходимость оборудования, обработки или надежность полученных данных.

И Бойден камера / Transwell анализ и царапины анализ / заживления ран анализ легко, недорогой и хорошо развитые анализы для измерения клеточной миграции в пробирке ^7-10. В камере Boyden / Transwell анализов клетки высевают на вершине вставки, содержащий пор (примерно 8 мкм в диаметре) – так называемого верхнего отсека ^7. Дополнительно, вставка может быть покрыта внеклеточного мКомпоненты Atrix, например, фибронектин, коллаген и т.д., чтобы имитировать более физиологической среде. Кроме того, эндотелиальные клетки могут быть выращены на верхней части вставки, таким образом, имитируя эндотелиальных клеток барьер ^13. Те клетки, которые прошли через поры в течение определенного интервала времени в нижнем отсеке, несущего носители и добавки, такие как факторы роста и хемокины, которые используются в качестве считывания для количественной оценки миграции клеток (или экстравазации).

В царапинам анализа / заживления ран анализов клетки высевают в виде пластин и выращивали до слияния ^10. В зависимости от экспериментальных условий пластин может быть предварительно покрыта компонентов внеклеточного матрикса, таких как фибронектин. После создания царапины / раны путем соскабливания Клеточный монослой отдельные клетки с каждой стороны от нуля / рана может мигрировать в зазор, тем самым заполнение / заживления, что ^10. Расстояние между двумя сторонами царапины / ран определяетсяв зависимости от времени и используется в качестве считывания для миграционной активности клеток ^10. Тем не менее, различать клеточной пролиферации (который также может привести к заправочной / заживления царапин / раны) и миграции клеток рекомендуется сочетать анализ с покадровой видео микроскопия и одна ячейка отслеживания ^10.

Однако, как Бойден камера / Transwell анализ и царапин анализ / заживления ран анализа, довольно несовершенное по поводу физиологического типа клеточной среде. В камере Boyden / анализов клетки Transwell должны мигрировать через пластиковую поры, в то время как в пустом анализа / заживления ран опробования клетки высевают на двумерной предварительно покрытых пластиковой пластины. Кроме того, она хорошо известна, что миграционное поведение заметно отличается от двумерной и 3D среде ^3. Например, трехмерная-матричные спайки фибробластов отличаться от координационных и фибриллярных спаек, характеризующихся на двамерные субстраты в их содержании α5β1 и V 3 интегринов, паксиллин, других цитоскелета компонентов, и фосфорилирования тирозина фокальной адгезии киназы ^14. Точно так же, клетки, встроенные в 3D-среде также отображается измененное миграционное поведение ^15. Таким образом проанализировать миграцию клеток точнее миграции анализ целей рекомендуется позволяющая измерять миграцию отдельных клеток в 3D-физиологической или физиологическая-среде.

Прижизненные изображения / микроскопия является золотым стандартом для измерения клеточной миграции в 3D-физиологическом аспекте. Это не только относится к внеклеточным матриксом-клеточных взаимодействий, но и взаимодействий между различными типами клеток, таких как опухолевые клетки и эндотелиальных клеток в течение ¹⁶ или экстравазации торговли лимфоцитов в лимфатическом узле ^17, который, на сегодняшний день, возможно за счет улучшенные методы флуоресцентной микроскопии, такие как 2-фотонаконфокальной лазерной сканирующей микроскопии, использование жизненно важных красителей и флуоресцентных трансгенных линий мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки производные ^12,16,17. Кроме того, прижизненной визуализации / микроскопия может быть в сочетании с ручной и автоматизированной клеток отслеживания ^18. Однако, в связи с необходимостью из 2-фотона конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, а также животных (и соответствующих трансгенных животных моделях) прижизненной визуализации / микроскопии является метод довольно дорогостоящим.

Чтобы преодолеть ограничения на Бойдена камеры / Transwell анализа и царапины анализ / заживления ран анализа и анализа миграции различных типов клеток в 3D-среде 3D коллагеновый матрикс миграции был разработан анализ ^11,19. Таким образом, мигрирующие клетки, встроенные в 3D сети коллагеновых волокон, которые больше напоминает в в естественных условиях обстановки. Совместно, в связи с покадровой видео микроскопии миграции в реальном клеток измеряется позволяя установнация из нескольких параметров миграции, а также их изменения в ответ на про-миграционных факторов или ингибиторов. Различные типы клеток могут быть проанализированы с помощью этой техники, в том числе лимфоцитов и лейкоцитов, ^11,20 / гемопоэтических стволовых клеток-предшественников ^21-24 и опухолевых клеток ^5,25-29. В дополнение к одиночных клеток также кластеры клеток или сфероидов может быть встроен в коллагеновой матрицы, одновременно с анализом эмиграции отдельных клеток от клеток кластера / сфероида в коллагена решетки ^30,31.

Этот протокол представляет обзор о простой, но мощной техники для анализа миграционное поведение различных типов клеток в 3D-среде – методом в пробирке уступая в результатах, которые близки к в естественных условиях ситуации.

Protocol

1 Подготовка миграции палат Подготовьте парафин / вазелин (1: 1) смесь и тепла, пока смесь растает. Использование Кисти малярные и привлечь 2-3 слоев парафина / вазелином (1: 1) смешать в середине стекло согласно рис 1B-1D. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем общие предметные стекла (76 х 2…

Representative Results

Используется 3D-коллагеновый матрикс анализа миграции в сочетании с покадровой видео-микроскопии и отслеживания клеток с помощью компьютера позволяет для определения различных параметров миграции клеток в том числе как параметра населения на основе (например, средней двигатель?…

Discussion

Способность мигрировать является отличительной чертой опухолевых клеток ^4. Без способности отделить от первичной опухоли и мигрировать через окружающие соединительной ткани опухолевых клеток не будет возможности раздавать вторичных поражений, которые являются основной причи…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petrolatum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% Sodium Bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use