Analisi della migrazione delle cellule all'interno di una tridimensionale di collagene Matrix
Summary
Migrazione delle cellule è un fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di fisiologica, come la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie, e dei processi fisiopatologici, come il cancro. Il test di migrazione matrice 3D-collagene è uno strumento versatile per analizzare le proprietà migratorie dei diversi tipi di cellule all'interno di in un ambiente fisiologico simile a 3D.
Abstract
La capacità di migrare è un segno distintivo di vari tipi di cellule e svolge un ruolo fondamentale in numerosi processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, e le risposte immunitarie. Tuttavia, la migrazione cellulare è anche un meccanismo chiave nel cancro consentire queste cellule tumorali a staccarsi dal tumore primario per avviare la diffusione metastatica. All'interno di questi ultimi anni sono stati sviluppati vari metodi di migrazione delle cellule per analizzare il comportamento migratorio dei diversi tipi di cellule. Poiché il comportamento locomotorio di cellule differisce notevolmente tra un bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) ambiente si può presumere che l'analisi della migrazione delle cellule che sono incorporati in un ambiente 3D produrrebbe nella migrazione cellulare più significativo dati. Il vantaggio della matrice di collagene 3D dosaggio migrazione descritto è che le cellule sono incorporate all'interno di una rete fisiologica 3D di fibre di collagene che rappresentano il principale componente della matrice extracellulare. A causa ditime-lapse videomicroscopia migrazione cellulare reale viene misurata permettendo la determinazione di diversi parametri di migrazione e loro alterazioni in risposta a fattori pro-migratori o inibitori. Vari tipi di cellule potrebbero essere analizzati con questa tecnica, tra cui linfociti / leucociti, cellule staminali e cellule tumorali. Allo stesso modo, anche i gruppi di cellule o sferoidi possono essere incorporati all'interno della concomitante matrice di collagene con analisi della emigrazione di singole cellule dal cluster di cellule / sferoide nel reticolo di collagene. Concludiamo che la matrice di collagene 3D test di migrazione è un metodo versatile per analizzare la migrazione delle cellule all'interno di un ambiente 3D fisiologico-like.
Introduction
Come la fusione cellulare (per una rassegna cfr 1,2) migrazione delle cellule è un altro fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie (per una rassegna vedi 3). Tuttavia, la capacità di migrare è anche un prerequisito per le cellule tumorali a metastatizzare (per una rassegna vedi 3,4).
Migrazione delle cellule è un complesso, non ancora pienamente compreso processo che è diretto dal gioco delle diverse vie di trasduzione del segnale iniziata da diversi ligando (ad esempio, citochine, chemochine, fattori di crescita, ormoni, componenti della matrice extracellulare) del recettore (ad esempio, tirosin-chinasi del recettore, recettori per le chemochine, integrine) interazioni 5 in ultima analisi, che causano la riorganizzazione del citoscheletro di actina concomitante con de- e rimontaggio di complessi di adesione focale e integrina-mediata segnalazione 6.
<p class = "jove_content"> Per analizzare la migrazione delle cellule diverse in vitro e in vivo test di migrazione delle cellule sono stati sviluppati negli ultimi decenni, tra cui il saggio di Boyden camera / transwell 7, scratch test / guarigione della ferita test 8-10, tridimensionale ( 3D) matrice di collagene migrazione dosaggio 11, nonché l'imaging intravitale / microscopia (per una rassegna vedi 12). Ciascuno di questi saggi di migrazione cellulare ha pro e contro, ad esempio, in materia di costi e necessità di attrezzature, il trattamento o l'affidabilità dei dati ottenuti.Sia la camera di Boyden / transwell test e il test graffio / dosaggio guarigione della ferita sono facili, a basso costo e saggi ben sviluppati per misurare la migrazione delle cellule in vitro 7-10. Nella camera di Boyden / transwell cellule test vengono seminate sulla cima di un inserto contenente pori (circa 8 micron di diametro) – il cosiddetto vano superiore 7. Opzionale, l'inserto può essere rivestito con m extracellularecomponenti ATRIX, ad esempio, la fibronectina, collagene, ecc, per simulare un ambiente più fisiologico. Allo stesso modo, le cellule endoteliali possono essere coltivate sulla parte superiore dell'inserto, imitando in tal modo una barriera di cellule endoteliali 13. Quelle cellule che sono passati attraverso i pori durante un intervallo di tempo definito nel vano inferiore ospitare media e integratori, come i fattori di crescita e chemochine, sono usati come-out lettura di quantificare la migrazione cellulare (o stravaso).
Nel saggio graffio / guarigione cellule test ferite vengono seminate in piastre e sono coltivate a confluenza 10. In dipendenza delle piastre di regolazione sperimentali potrebbe essere pre-rivestito con componenti della matrice extracellulare, quali fibronectina. Dopo aver creato un graffio / ferita raschiando le singole cellule monostrato cellulare da ogni lato del graffio / ferita può migrare nello spazio vuoto, riempimento / guarigione è 10 quindi. La distanza tra i due lati del graffio / ferite è determinatain dipendenza del tempo ed è utilizzato come un out lettura per l'attività migratoria delle cellule 10. Tuttavia, per discriminare tra proliferazione cellulare (che potrebbe anche tradursi in riempimento / guarigione del graffio / ferita) e la migrazione cellulare si consiglia di combinare l'analisi con microscopio video time-lapse e di singola cellula di monitoraggio 10.
Tuttavia, sia la camera di Boyden / transwell test e scratch test / guarigione della ferita test, sono piuttosto imperfetto, concernente un ambiente cellulare fisiologico-like. Nella camera di Boyden / cellule dosaggio transwell devono migrare attraverso un poro di plastica, mentre nel scratch test / guarigione della ferita cellule del test vengono seminate su un piatto di plastica bidimensionale pre-rivestito. Allo stesso modo, è ben noto che il comportamento migratorio differisce marcatamente tra un ambiente bidimensionale e 3D 3. Per esempio, aderenze tridimensionale a matrice di fibroblasti differiscono da adesioni focali e fibrillari caratterizzati su duesubstrati -dimensionale nel loro contenuto di α5β1 e integrine αvβ3, paxillina, altri componenti del citoscheletro, e la fosforilazione della tirosina chinasi di adesione focale 14. Allo stesso modo, le cellule incorporati all'interno di un ambiente 3D visualizzate anche un comportamento migratorio alterato 15. Così per analizzare la migrazione cellulare più accuratamente un saggio di migrazione è raccomandato consentendo di misurare la migrazione di cellule singole all'interno di un ambiente fisiologico o fisiologico simile 3D.
Imaging intravitale / microscopia è il gold-standard per misurare la migrazione delle cellule all'interno di un contesto fisiologico 3D. Questo non appartiene solo alle interazioni matrice extracellulare delle cellule, ma anche per le interazioni tra diversi tipi di cellule, come le cellule tumorali e le cellule endoteliali durante stravaso 16 o il traffico dei linfociti nel linfonodo 17, che, ad oggi, è possibile grazie al miglioramento delle tecniche di microscopia a fluorescenza, come 2-fotonemicroscopio confocale a scansione laser, l'uso di coloranti fluorescenti vitali e ceppi di topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti derivati 12,16,17. Inoltre, l'imaging intravitale / microscopia può essere combinato con il monitoraggio delle cellule manuale e automatica 18. Tuttavia, a causa della necessità di un 2-fotone microscopio confocale a scansione laser e animali (e appropriati modelli animali transgenici) intravitale immagini / microscopia è una tecnica piuttosto intenso costi.
Per superare le limitazioni della camera di Boyden / transwell test e il test di guarigione scratch test / ferita e per analizzare la migrazione di diversi tipi di cellule all'interno di un ambiente 3D 3D matrice di collagene test di migrazione è stato sviluppato 11,19. In tal modo, le cellule che migrano sono incorporate all'interno di una rete in fibra di collagene 3D, che più somiglia alla situazione in vivo. Congiuntamente, a causa di time-lapse microscopia video di migrazione delle cellule reale si misura permettendo determinazione di diversi parametri di migrazione e loro alterazioni in risposta a fattori pro-migratori o inibitori. Vari tipi di cellule potrebbero essere analizzati con questa tecnica, compresi i linfociti e leucociti 11,20, staminali emopoietiche / progenitrici 21-24, e le cellule tumorali 5,25-29. Oltre alle cellule singole anche cellulare cluster o sferoidi possono essere incorporati all'interno della concomitante matrice di collagene con analisi della emigrazione di singole cellule dal cluster di cellule / sferoide nel collagene reticolo 30,31.
Questo protocollo presenta una panoramica su una tecnica semplice, ma potente per analizzare il comportamento migratorio dei diversi tipi di cellule all'interno di un ambiente 3D – un metodo in vitro ottenendo dei risultati che sono vicine alla situazione in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di migrare è una caratteristica delle cellule tumorali 4. Senza la possibilità di staccarsi dal tumore primario e migrare attraverso le circostanti cellule tumorali tessuto connettivo non sarà in grado di seminare lesioni secondarie, che sono la principale causa di morte di quasi tutti i pazienti affetti da cancro. A causa di questa relazione molti studi si stanno concentrando sulla migrazione delle cellule del cancro. Lo scopo di questi studi è l'identificazione di nuove molecole target …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica DM IL inverted microscope | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| Microscope stage heater | Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany | ||
| JVC C1431 video camera | JVC, Bad Vilbel, Germany | ||
| Axis 241Q video server | Axis communication GmbH, Ismaning, Germany | ||
| Mac G5 Computer | Apple Macintosh | ||
| iMac | Apple Macintosh | ||
| FileMaker Pro | FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Multi-camera video surveillance software(Security Spy) | Bensoftware, London, UK | ||
| Runtime Revolution Media 2.9.0 | RunRev Ltd., Edinburgh, UK | ||
| Paraffin | Applichem GmbH, Darmstadt, Germany | A4264 | |
| Petrolatum jelly | local drug store | ||
| Purecol (liquid collagen) | Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands | contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV) | |
| 10x MEM | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M0275 | |
| 7.5% Sodium Bicarbonate solution | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | S8761 | |
| EGF | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | E9644 | |
| U73122 | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | 662035 | dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use |
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