Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

Summary

La migración celular es un fenómeno biológico que está involucrada en una gran cantidad de fisiológicos, tales como la curación de heridas y las respuestas inmunitarias, y los procesos fisiopatológicos, como el cáncer. El ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es una herramienta versátil para analizar las propiedades migratorias de diferentes tipos de células dentro de un entorno fisiológico-como 3D.

Abstract

La capacidad de migrar es un sello de diversos tipos de células y juega un papel crucial en diversos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, y la respuesta inmune. Sin embargo, la migración celular también es un mecanismo clave en el cáncer permitiendo estas células cancerosas para desprenderse del tumor primario para iniciar la diseminación metastásica. En los últimos años se han desarrollado varios ensayos de migración celular para analizar el comportamiento migratorio de diferentes tipos de células. Debido a que el comportamiento de locomoción de las células difiere notablemente entre una de dos dimensiones (2D) y tres dimensiones medio ambiente (3D) se puede suponer que el análisis de la migración de las células que están incrustados dentro de un entorno 3D produciría en la migración celular más significativo datos. La ventaja del ensayo de migración de matriz de colágeno 3D descrito es que las células están incrustadas dentro de una red 3D fisiológica de las fibras de colágeno que representan el componente principal de la matriz extracelular. Debido alapso de tiempo de microscopía de vídeo real de la migración celular se mide permitiendo la determinación de varios parámetros de migración, así como sus alteraciones en respuesta a factores pro-migratorias o inhibidores. Varios tipos de células podrían ser analizados usando esta técnica, incluyendo linfocitos / leucocitos, células madre, y células tumorales. Del mismo modo, también grupos de células o esferoides pueden ser incrustados dentro de la matriz de colágeno concomitante con el análisis de la emigración de las células individuales del grupo de células / esferoide en la red de colágeno. Llegamos a la conclusión de que el ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es un método versátil para analizar la migración de células dentro de un entorno 3D-como fisiológico.

Introduction

Al igual que la fusión celular (para una revisión ver ^1,2) la migración celular es otro fenómeno biológico que está involucrado en una plétora de procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y las respuestas inmunes (para una revisión véase ^3). Sin embargo, la capacidad de migrar es también un requisito previo para las células tumorales metastatizan a (para revisión ver ^3,4).

La migración celular es un complejo, proceso aún no completamente entendido que está dirigida por la interacción de varias vías de transducción de señales iniciada por varios ligando (por ejemplo, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas, componentes de la matriz extracelular) del receptor (por ejemplo, tirosina quinasas receptoras, receptores de quimioquinas, integrinas) interacciones ⁵ en última instancia provocan la reorganización del citoesqueleto de actina concomitante con de- y montaje de complejos de adhesión focal y la integrina mediada por la señalización ^6.

<p class = "jove_content"> Para el análisis de la migración de células de varios in vitro y en ensayos de migración celular in vivo se han desarrollado en las últimas décadas, incluyendo el ensayo Boyden cámara / transwell ^7, cero ensayo / cicatrización de heridas ensayo de ^8-10, en tres dimensiones ( 3D) ensayo de migración de matriz de colágeno ^11, así como intravital de imágenes / microscopía (para revisión ver ^12). Cada uno de estos ensayos de migración celular tiene ventajas y desventajas, por ejemplo, en relación con los costos y la necesidad de equipos, manipulación o fiabilidad de los datos obtenidos.

Tanto la cámara de ensayo Boyden / transwell y el ensayo ensayo de rayado / cicatrización de heridas son fáciles, de bajo costo y ensayos bien desarrollados para medir la migración de células in vitro ^7-10. En la cámara de Boyden / Transwell células de ensayo se siembran en la parte superior de un inserto que contiene poros (alrededor de 8 micras de diámetro) – el llamado compartimiento superior ^7. Opcional, el inserto podría ser recubierto con m extracelularAtrix componentes, por ejemplo, fibronectina, colágeno, etc, para imitar un entorno más fisiológico. Del mismo modo, las células endoteliales podrían ser cultivadas en la parte superior del inserto, imitando de ese modo una barrera de células endoteliales ^13. Aquellas células que han pasado a través de los poros durante un intervalo de tiempo definido en el compartimiento inferior que alberga medios de comunicación y los suplementos, tales como factores de crecimiento y quimiocinas, se utilizan como un dispositivo de lectura para cuantificar la migración celular (o extravasación).

En el ensayo de rayado / curativas células de ensayo de la herida se siembran en placas y se cultivan hasta la confluencia ^10. En dependencia de las placas de ajuste experimentales podría ser pre-recubierto con componentes de la matriz extracelular, tales como fibronectina. Después de crear un rasguño / herida por raspado de las células individuales en monocapa de células de cada lado del arañazo / herida puede migrar en el espacio, llenando así / curarla ^10. La distancia entre los dos lados de los arañazos / heridas se determinaen dependencia del tiempo y se usa como un dispositivo de lectura para la actividad migratoria de las células ^10. Sin embargo, para discriminar entre la proliferación celular (que podría resultar también en el llenado / curación del cero / herida) y la migración celular se recomienda combinar el ensayo con microscopía de vídeo de lapso de tiempo y de una sola célula de seguimiento ^10.

Sin embargo, tanto la cámara de Boyden / ensayo Transwell y cero ensayo / ensayo de cicatrización de la herida, son más bien imperfecta relativa a un entorno celular-como fisiológico. En la cámara de Boyden / células de ensayo Transwell tienen que migrar a través de un poro de plástico, mientras que en el ensayo de rayado / cicatrización de heridas células de ensayo se sembró en una placa de plástico pre-recubierto de dos dimensiones. Asimismo, es bien reconocido que el comportamiento migratorio difiere notablemente entre un medio ambiente de dos dimensiones y 3D ^3. Por ejemplo, las adherencias en tres dimensiones de matriz de fibroblastos se diferencian de las adhesiones focales fibrilares y caracterizados en dossustratos -dimensionales en su contenido de α5β1 y integrinas αvβ3, paxilina, otros componentes del citoesqueleto, y la fosforilación de tirosina quinasa de adhesión focal ^14. Del mismo modo, las células embebidas dentro de un entorno 3D también muestran un comportamiento migratorio alterada ^15. Así, para analizar la migración de células con más precisión un ensayo de migración se recomienda permitir para medir la migración de células individuales dentro de un entorno fisiológico o fisiológico-como 3D.

Intravital de imágenes / microscopía es el estándar de oro para la medición de la migración de células dentro de un contexto fisiológico 3D. Esto no sólo pertenecen a las interacciones célula-matriz extracelular, sino también a las interacciones entre los diferentes tipos de células, tales como células tumorales y las células endoteliales durante la extravasación ¹⁶ o el tráfico de linfocitos en el ganglio linfático ^17, que, hasta la fecha, es posible debido a mejora de las técnicas de microscopía de fluorescencia, tales como 2-fotónmicroscopía de barrido láser confocal, el uso de colorantes fluorescentes vitales y cepas de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes derivados ^12,16,17. Además, intravital de imágenes / microscopía podría combinarse con el seguimiento de células manual y automatizado ^18. Sin embargo, debido a la necesidad de un 2-fotón láser confocal de microscopía de barrido, así como animales (y modelos de animales transgénicos adecuados) intravital de imágenes / microscopía es una técnica bastante onerosa.

Para superar las limitaciones de la cámara de ensayo Boyden / transwell y el ensayo de curación de cero ensayo / herida y para analizar la migración de diferentes tipos de células dentro de un entorno 3D el ensayo de migración de matriz de colágeno 3D fue desarrollado ^11,19. De esta manera, las células que migran están incrustados dentro de una red de fibras de colágeno en 3D, lo que más se asemeja a la situación in vivo. Conjuntamente, debido al time-lapse video microscopía migración celular verdadero se mide lo que permite la deternación de varios parámetros de migración, así como sus alteraciones en respuesta a factores pro-migratorias o inhibidores. Varios tipos de células podrían ser analizados usando esta técnica, incluyendo linfocitos y leucocitos ^11,20 madre hematopoyéticas, células progenitoras / ^21-24, y las células tumorales ^5,25-29. Además de las células individuales también cúmulos celulares o esferoides pueden ser incrustados dentro de la matriz de colágeno concomitante con el análisis de la emigración de las células individuales del grupo de células / esferoide en el colágeno celosía ^30,31.

Este protocolo presenta una visión general acerca de una técnica sencilla, pero de gran alcance para analizar el comportamiento migratorio de diferentes tipos de células dentro de un entorno 3D – un método in vitro ceder en los resultados que están cerca de la situación in vivo.

Protocol

1 Preparación de Cámaras de migración Preparar una jalea de cera de parafina / petróleo (1: 1) mezcla y calentar hasta que la mezcla se haya derretido. El uso de un cepillo de pintura y dibujar 2-3 capas de la jalea de cera de parafina / petróleo (1: 1) mezclar en el medio de la lámina de vidrio de acuerdo a las figuras 1B-1D. NOTA: Estamos utilizando portaobjetos de vidrio común (76 x 26 x 1,0 a 1,5 mm (W / D / H)) Aplique la mezcla de gelatina de cera de parafina / p…

Representative Results

El ensayo de migración de matriz 3D-colágeno utilizado combinado con lapso de tiempo de video-microscopía y seguimiento celular asistida por ordenador permite la determinación de diversos parámetros de migración celular, incluyendo tanto parámetro basado en la población (por ejemplo, la media de la actividad locomotriz) y parámetros basados ​​en células individuales (por ejemplo, el tiempo de movimiento activo, velocidad, distancia migró). Un ejemplo de los conjuntos de datos de seguimie…

Discussion

La capacidad de migrar es una característica de las células tumorales ^4. Sin la capacidad de desprenderse del tumor primario y para migrar a través de las células tumorales del tejido conectivo circundante no será capaz de sembrar lesiones secundarias, que son la principal causa de muerte de casi todos los pacientes con cáncer. Debido a esta relación muchos estudios se centran en la migración de células de cáncer. El objetivo de estos estudios es la identificación de nuevas moléculas diana y las v…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petrolatum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% Sodium Bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use