القياس الآلي للالرئوي وانتفاخ الرئة ومجرى الهواء الصغيرة في إعادة عرض السجائر الفئران المعرضة للدخان
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
استخدام نماذج حيوانية لدراسة COPD يمثل تحديا لأنه لا يوجد نموذج يمكن نسخ تماما عن ملامح من الأمراض التي تصيب البشر (2). معظم المحققين استخدام الفئران لنموذج COPD بسبب التشابه بين الفئران والبشر في حياتهم الرئوية علم وظائف الأعضاء، علم الأمراض، وعلم الوراثة، والأيض. أيضا، الفئران غير مكلفة نسبيا للدراسة، وكلا انتفاخ الرئة وإعادة الهوائية الصغيرة تتطور في غضون 6 أشهر من التعرض CS (5،7-9).
السجائر التي يسببها الدخان COPD: يمكن أن العديد من الطرق لحث COPD في الفئران. معظم الباحثين تعرض الفئران لCS، وهو عامل خاص بأسباب الأمراض الرئيسي لمرض الانسداد الرئوي المزمن البشري. التعرض CS لمدة 6 أشهر يسبب تطوير انتفاخ الرئة وإعادة الهوائية الصغيرة (SAR) في الفئران، ولكن شدة المرض التي يسببها تختلف تبعا لسلالة الفئران التي شملتها الدراسة. على سبيل المثال، الفئران NZWLacZ مقاومة لتطوير انتفاخ الرئة CS التي يسببها في حين الفئران AKR / J هي extremel ذ حساسة (10). معظم الباحثين يدرسون C57BL / 6 الفئران سلالة في نموذج التعرض CS كثيرة كما الفئران التي تستهدف الجينات المتاحة في هذه السلالة. بعد 6 أشهر من CS التعرض، وانتفاخ الرئة وتليف الهوائية الصغيرة في تطوير نوع البرية (WT) C57BL / 6 الفئران، وكلا الآفات معتدل نسبيا في شدتها (5،10). يستخدم الباحثون نوعين من CS التعرض: التعرض الأنف فقط وكامل الجسم. المساوئ الرئيسية للفقط الأنف تقنية التعرض هي: 1) أنه هو وسيلة كثيفة العمالة أكثر؛ و2) الفئران لا بد من ضبط النفس في غرف صغيرة والتي يمكن أن تحدث استجابة التوتر وارتفاع الحرارة في الحيوانات (11). العيب الرئيسي للتعرض كامل الجسم (الموصوفة هنا) هو أن الحيوانات يمكن استيعاب (وكذلك يستنشق) النيكوتين والقطران المنتجات عندما تنظيف فرائها. الفئران المعرضة لكامل الجسم CS أيضا انخفاض مستويات كربوكسي هيموغلوبين وتخفيض فقدان وزن الجسم بالمقارنة مع الحيوانات المعرضة للأنف فقط CS (12).
<p claق ق = "jove_content"> الرئوي اختبار وظيفة (PFTs): تدابير الامتثال الرئة ومرانية وعادة ما تكون مماثلة في C57BL / 6 النوع البري (WT) الفئران المعرضة للهواء أو CS لمدة 6 أشهر بسبب انتفاخ معتدل نسبيا الذي يضع فيه هذا يتعرض سلالة لCS (10). ومع ذلك، عندما تدمير نفاخي هو أكثر شدة، والزيادات في الامتثال الرئة اليسرى والتحولات في الحجم الضغط (PV) تتدفق يمكن الكشف عن الحلقات. هذا الأخير يمكن ملاحظتها، على سبيل المثال، في سلالات الفئران التي هي أكثر عرضة لآثار CS (10)، في CS تتعرض / 6 سلالة الفئران التي تستهدف الجينات C57BL التي لديها نوع انتفاخ الرئة أشد من C57BL / 6 الفئران WT (13)، أو في الفئران CS-تتعرض تعرض للتغيرات البيئية التي تجعلها أكثر عرضة لآثار CS (14). يستخدم هذا البروتوكول جهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة لقياس تخفيضات في الارتداد المرن من الرئة (الزيادات في الامتثال الرئة quasistatic [سنتي ستوك] وتخفيضات في الأنسجةمرانية [H])، حلقات تدفق PV، والتغيرات في مقاومة مجرى الهواء والأنسجة في الفئران تخدير (15،16).تدابير من انتفاخ الرئة: تحليل التنمية انتفاخ الرئة في CS-تتعرض C56BL / 6 سلالة الفئران هي صعبة بسبب توزيعه هو غير متجانسة مكانيا. عدة طرق مختلفة قياس توسيع المجال الجوي في الفئران. وكان أول الطرق المستخدمة في متوسط اعتراض خطي (L م) (17). ومع ذلك، الأسلوب L م هو بطيئة، عملية يدوية والتي قد لا التقاط عدم التجانس هذا المرض (ما لم يتم أخذ عينات جميع أقسام الرئة بشكل عشوائي) واستخدامه بالتالي قد يعرض التحيز مراقب في التحليل. مؤشر مدمرة [DI، (18)] يقيس أيضا توسيع المجال الجوي باستخدام ورقة شفافة مع 50 نقطة موزعة بالتساوي وضعت على صورة رقمية مطبوعة من الهيماتوكسيلين والقسم الرئة الملطخة يوزين. طريقة PI عشرات المنطقة المحيطة بكل ميلان نقطةحبال إلى المدى الذي يتم تدمير القنوات السنخية والجدران السنخية في هذا المجال. العيب الرئيسي للطريقة DI هو أنه يستغرق وقتا طويلا وليس أكثر دقة من الطرق الأخرى (19،20).
يقيس هذا البروتوكول تعني السنخية طول الوتر ومنطقة السنخية على أقسام الرئة جزءا لا يتجزأ من البارافين ملطخة وصمة عار في جيل. برنامج قياس الأشكال تحويل الصور من أقسام الرئة إلى صور ثنائية (في الأنسجة التي هي بيضاء والمجال الجوي أسود)، ثم تطغى شبكة موحدة من الخطوط الأفقية والعمودية (الحبال) والبرمجيات ثم يقيس طول كل وتر داخل المناطق التي حددتها البرمجيات والمجال الجوي. باستخدام هذه الطريقة، فمن الممكن لقياس حجم الحويصلات الهوائية في جميع أنحاء الرئة بطريقة موحدة ومؤتمتة نسبيا (21).
إعادة عرض الهوائية الصغيرة (SAR): إن ترسب زيادة البروتينات ECM (خاصة interstitiaل الكولاجين) حول الهوائية الصغيرة يحدث في الحيوانات CS يتعرض-ويسهم في تدفق الهواء العرقلة. الباحثون لا دراسة SAR في النماذج الحيوانية للمرض الانسداد الرئوي المزمن في كثير من الأحيان مثل التنمية انتفاخ الرئة (22). لتحديد SAR في الفئران المعرضة CS، هذا البروتوكول يستخدم برمجيات تحليل الصور لقياس سمك طبقة من البروتينات ECM أن يترسب في جميع أنحاء الهوائية الصغيرة (الممرات الهوائية التي يبلغ قطرها متوسط ما بين 300 و 899 م) في أقسام الرئة جزءا لا يتجزأ من البارافين ملطخة بالترسيب وصمة عار ماسون.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر فرانشيسكا Polverino MD، وهو زميل باحث في بريجهام ومستشفى النساء لمساهمتها في هذه المادة، وكذلك مونيكا ياو، BS، وكيت ريدل، BS على المساعدة التي قدموها مع تربية الفئران وتعريض الفئران لدخان السجائر.
وأيد هذا العمل من قبل دائرة الصحة العامة، القومي للقلب والرئة والدم المعهد منح HL111835، HL105339، HL114501، الطيران الحضور معهد البحوث الطبية غرانت # CIA123046، وبريجهام ومستشفى النساء-افليس الجهاز التنفسي معهد بحوث اتحاد، وكامبردج NIHR الطبية الحيوية مركز الأبحاث.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
References
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
- Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
- Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
- Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
- Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
- Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
- van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
- Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
- Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
- Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172 (2013).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
- Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The ‘destructive index’ in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
- Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
- Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
- McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
- Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).
