Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
L'uso di modelli animali per lo studio BPCO è impegnativo, perché nessun modello può riprodurre perfettamente tutte le caratteristiche della malattia umana (2). La maggior parte dei ricercatori utilizzano topi per modellare la BPCO a causa delle somiglianze tra i topi e gli esseri umani nella loro polmonari fisiologia, patologia, genetica, e metaboliti. Inoltre, i topi sono relativamente poco costoso per studiare, e sia l'enfisema e la piccola rimodellamento delle vie aeree si sviluppano entro 6 mesi di esposizione CS (5,7-9).
Il fumo di sigaretta indotta BPCO: Diversi metodi possono indurre BPCO nei topi. Molti ricercatori espongono topi per CS, che è il fattore eziologico principale per BPCO umana. Esposizione CS per 6 mesi provoca lo sviluppo di enfisema e piccole rimodellamento delle vie aeree (SAR) nei topi, ma la gravità della malattia che viene indotta varia a seconda del ceppo murino studiata. Per esempio, i topi NZWLacZ sono resistenti allo sviluppo di enfisema CS-indotta che AKR / J topi sono extremely sensibili (10). La maggior parte dei ricercatori studiano C57BL / 6 topi deformazione del modello di esposizione CS come tanti topi del gene targeting sono disponibili in questo ceppo. Dopo 6 mesi di esposizione CS, enfisema e fibrosi piccole vie aeree sviluppano in wild type (WT) C57BL / 6 topi, ed entrambe le lesioni sono relativamente mite a gravità (5,10). I ricercatori utilizzano due tipi di CS dell'esposizione: esposizioni naso-solo e tutto il corpo. I principali svantaggi del naso di sola tecnica di esposizione sono che: 1) si tratta di un metodo più alta intensità di manodopera; e 2) topi devono essere trattenuto in piccole sezioni che possono indurre una risposta allo stress e ipertermia negli animali (11). Il principale svantaggio di esposizione al corpo intero (qui descritto) è che gli animali possono ingerire (così come inalare) nicotina e catrame prodotti quando hanno pulito la loro pelliccia. I topi esposti a corpo intero CS hanno livelli di carbossiemoglobina inferiori e ridotto la perdita di peso corporeo rispetto animali esposti a naso sola CS (12).
<p class = "jove_content"> test di funzionalità polmonare (PFT): Misure di compliance polmonare e elastanza solito sono simili in C57BL / 6 wild type (WT) topi esposti all'aria o CS per 6 mesi a causa della enfisema relativamente mite che si sviluppa quando il ceppo è esposto CS (10). Tuttavia, quando la distruzione enfisematosa è più grave, aumenti di compliance polmonare e si sposta a sinistra del volume pressione (PV) flusso loop possono essere rilevati. Quest'ultimo può essere osservato, per esempio, in ceppi murini che sono più sensibili agli effetti di CS (10), in CS-esposti / 6 ceppo topi C57BL gene-targeting che hanno un tipo di enfisema più grave di C57BL / 6 topi WT (13), o in topi CS-esposti soggetti a cambiamenti ambientali che li rendono più sensibili agli effetti di CS (14). Questo protocollo utilizza un piccolo ventilatore animali per misurare la riduzione del ritorno elastico del polmone (aumento della compliance polmonare quasi statica [Cost] e riduzioni nel tessutoelastanza [H]), flussi di loop PV, e cambiamenti nella resistenza delle vie aeree e dei tessuti in topi anestetizzati (15,16).Misure di enfisema polmonare: Analisi dello sviluppo dell'enfisema in CS-esposti C56BL / 6 ceppo topi è impegnativo, perché la sua distribuzione è spazialmente eterogenea. Diversi metodi differenti quantificano l'allargamento dello spazio aereo nei topi. Il primo metodo è stato utilizzato il mezzo di intercettazione lineare (L m) (17). Tuttavia, il metodo L m è un lento processo manuale che non può catturare l'eterogeneità della malattia (a meno che tutte le sezioni del polmone vengono campionati a caso) e il suo impiego può quindi introdurre bias osservatore nell'analisi. L'indice distruttivo [DI, (18)] quantifica anche l'allargamento dello spazio aereo utilizzando un foglio trasparente con 50 punti equamente distribuiti posizionati sopra un'immagine digitalizzata stampata di un ematossilina e la sezione del polmone eosina macchiato. Il metodo PI punteggi zona circostante ogni punto accondo la misura in cui i condotti alveolari e pareti alveolari all'interno di questa zona sono distrutti. Lo svantaggio principale del metodo DI è che richiede tempo e non più preciso di altri metodi (19,20).
Questo misure protocollo significano lunghezza della corda alveolare e zona alveolare su sezioni polmonari in paraffina colorate con macchia di Gill. Morfometria software converte le immagini di sezioni polmonari alle immagini binarie (in cui il tessuto è bianco e spazio aereo è nero), e poi sovrappone una griglia uniforme di linee orizzontali e verticali (corde) e il software poi quantifica la lunghezza di ciascuna corda all'interno di aree individuate dalla software come spazio aereo. Utilizzando questo metodo, è possibile misurare le dimensioni degli alveoli in tutte le parti del polmone in modo standardizzato e relativamente automatizzato (21).
Piccolo rimodellamento delle vie aeree (SAR): La maggiore deposizione di proteine ECM (soprattutto interstitial collagene) intorno piccole vie aeree tra gli animali CS-esposti e contribuisce a ostruzione delle vie aeree. I ricercatori non studiano SAR in modelli animali di BPCO frequentemente come sviluppo enfisema (22). Per quantificare SAR in topi CS-esposti, questo protocollo utilizza il software di analisi di immagine per misurare lo spessore dello strato di proteine ECM che si deposita intorno piccole vie aeree (airways avente un diametro medio compreso tra 300 e 899 m) nelle sezioni polmonari paraffina colorati con colorazione tricromica di Masson.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Francesca Polverino MD, Research Fellow presso il Brigham and Women Hospital per il suo contributo a questo articolo, e anche Monica Yao, BS, e Kate Rydell, BS per la loro assistenza con allevamento murina ed esponendo i topi al fumo di sigaretta.
Questo lavoro è stato sostenuto dal servizio Public Health, National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL111835, HL105339, HL114501, assistenti di volo Medical Research Institute di Grant # CIA123046, il Brigham and Institute Consorzio Ospedale-Lovelace Respiratory Research delle donne, e la Cambridge NIHR biomedica Centro di Ricerca.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
References
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