肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
ないモデルが完全ヒト疾患（2）のすべての機能を複製することができないので、COPDを研究するための動物モデルの使用は困難である。ほとんどの研究者は、それらの肺生理学、病理学、遺伝学、および代謝物のマウスとヒトの間の類似性のCOPDをモデル化するために、マウスを使用しています。また、マウスは勉強するのが比較的安価であり、肺気腫、小さな気道リモデリングの両方がCS曝露（5,7-9）の6カ月以内に発症する。
タバコの煙によって誘発されるCOPD：いくつかの方法が、マウスにおいてCOPDを誘発することができる。ほとんどの研究者は、人間のCOPDの主な病因因子であるCS、にマウスを公開。 6ヶ月のCS曝露は、マウスにおいて肺気腫および小さな気道リモデリング（SAR）の開発を引き起こすが、誘導される疾患の重症度を検討マウス株に依存して変化する。 AKR / Jマウスはextremelであるのに対し、例えば、NZWLacZマウスは、CS誘発性肺気腫の発症に耐性である感受性のy（10）。ほとんどの研究者は、多くの遺伝子標的マウスとしてのCS暴露モデルでC57BL / 6系統のマウスを研究この株でご利用いただけます。 CS暴露の6ヵ月後、肺気腫、小気道線維症は、野生型（WT）C57BL / 6マウスで開発し、両方の病変が重症度（5,10）で比較的穏やかです。鼻専用および全身曝露：研究者は、CS暴露の2種類を使用しています。 1）それは、より労働集約的な方法であり：鼻のみの露光技術の主な欠点は、ということです2）マウスを、動物のストレス応答および温熱療法を誘導することができる小室（11）に拘束されなければならない。 （本明細書に記載）の全身暴露の主な欠点は、それらの毛を掃除するとき、動物がニコチンとタール製品を摂取する（同様に吸い込む）ことができることである。全身CSに曝露されたマウスは、より低いヘモグロビンレベルを有し、鼻のみCS（12）に曝露した動物と比較して、体重の損失を減少させた。
<p class = "jove_content"> 肺機能検査（のPFT）：肺コンプライアンスとエラスタンスの措置がこの開発は比較的軽度肺気腫による6ヶ月間空気またはCSに暴露されたC57BL / 6野生型（WT）マウスでは、通常は似ています株は、CS（10）に露出している。気腫性の破壊はより重篤である場合しかし、肺コンプライアンスと圧力 – 体積（PV）の左シフトの増加は、ループを検出することができる流れる。後者は、C57BL / 6 WTマウスよりもより重度の肺気腫型を持つCS曝露C57BL / 6系統の遺伝子標的マウスにおいて、CS（10）の影響を受けやすいマウス株では、例えば、観察することができる（13）、またはCS（14）の影響をより受けやすく、環境の変化にさらさCS曝露マウスで。このプロトコルは、組織における肺の弾性反跳（準静的肺コンプライアンスの増加[Cstに]の削減と削減を測定するための小動物人工呼吸器を使用していますエラスタンス[H]）、PVフローループ、麻酔したマウス（15,16）における気道組織抵抗の変化。肺気腫の措置：その分布が空間的に不均一であるため、CS-暴露C56BL / 6系統のマウスでの肺気腫の開発の分析は困難である。いくつかの異なる方法は、マウスの空域の拡大を定量化する。使用された最初の方法は、平均線インターセプトさ（L M）（17）であった。しかし、LのM法は（肺のすべてのセクションがランダムにサンプリングされていない限り）疾患の不均一性をキャプチャしない場合があり、その使用は、したがって、分析にオブザーバーバイアスを導入する可能性が遅く、手動のプロセスです。破壊的なインデックス[DI、（18）]は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色した肺切片の印刷されたデジタル化された画像の上に置か50均等に分配ポイントを持つ透明シートを使用して空域の拡大を定量化する。 PI法のスコア各ポイントのACを囲む領域この領域内の肺胞管と肺胞壁が破壊される程度にコーディング。 DI方式の主な欠点は、時間がかかり、他の方法（19,20）よりも正確ではないということである。
このプロトコル措置はギルの染料で染色パラフィン包埋肺切片上歯槽弦長と肺胞の領域を意味する。形態計測ソフトウェアは、（組織は白色であり、空域が黒色である）は、バイナリ画像に肺切片の画像を変換し、によって識別領域内の各弦の長さを定量化し、水平線と垂直線（コード）の一様格子とソフトウェアを重畳する空域などのソフトウェア。この方法を使用して、標準化された、比較的自動化方法（21）肺のすべての部分における肺胞の大きさを測定することが可能である。
小気道リモデリング（SAR）：ECMタンパク質沈着の増加（特にinterstitia小気道の周りのLコラーゲンは）CS-暴露動物で発生し、障害物を気流に貢献します。研究者は、肺気腫の開発（22）と同じ頻度でCOPDの動物モデルでSARを勉強しません。 CS曝露マウスにおけるSARを定量化するために、このプロトコルは、パラフィン包埋した肺切片における末梢気道（気道300と899メートルの間の平均直径を有する）の周りに堆積されるECMタンパク質の層の厚さを測定するために画像解析ソフトウェアを使用してマッソン三色染色で染色。
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、フランチェスカPolverino MD、この記事への彼女の貢献のためのブリガム·アンド·ウィメンズ病院での研究員、そしてまたモニカ八尾、BS、およびケイト·ライデル、ネズミ畜産とタバコの煙にマウスを曝露との援助のためにBSに感謝したい。
この作品は、公衆衛生局、国立心臓、肺、血液研究所補助金HL111835、HL105339、HL114501、客室乗務員医学研究所助成＃CIA123046、ブリガム·アンド·ウィメンズ病院·ラブレース呼吸器研究所コンソーシアム、ケンブリッジNIHR医学によってサポートされていました研究センター。
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
References
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