In vitro Funktionel karakterisering af Mouse Colorectal Afferent Endings
Summary
This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.
Abstract
Denne video i detaljer viser en in vitro single-fiber elektrofysiologiske optagelse protokol ved hjælp af en mus colorectum-nerve præparat. Tilgangen giver uvildig identifikation og funktionel karakterisering af individuelle kolorektale afferente. Ekstracellulære optagelser af opformerede aktionspotentialer (APS), der stammer fra en eller nogle få afferent (dvs. enkelt fiber) receptive felter (RFS) i colorectum er lavet af drillet nerve fiber hæfterne. Den colorectum fjernes med enten bækken (PN) eller lumbal splanknisk (LSN) nerve vedhæftet og åbnet på langs. Vævet anbringes i en optagelse kammer, pinned flad og perfunderet med oxygeneret Krebs-opløsning. Focal elektrisk stimulation anvendes til at lokalisere kolorektale afferente endelser, som yderligere testet af tre forskellige mekaniske stimuli (stump sondering, mucosal strøg og periferisk strækning) til funktionelt kategorisere afferenter i fem mechanosensitive klasser. Endings reagerer på ingen af disse mekaniske stimuli er kategoriseret som mekanisk ufølsomme afferente (Mias). Både mekanosensitive og Mias kan vurderes for overfølsomhed (dvs. forbedret respons, nedsat tærskel, og / eller erhvervelse af mechanosensitivity) ved lokal eksponering af RFS for kemikalier (f.eks inflammatorisk suppe (IS), capsaicin, adenosin trifosfat (ATP)). Vi beskriver udstyr og colorectum-nerve præparat optagelse, høst af colorectum med vedlagte PN eller LSN, identifikation af RFS i colorectum, single-fiber optagelse fra nerve hæfterne, og lokaliseret anvendelse af kemikalier til RF. Desuden er udfordringer i udarbejdelse og anvendelse af standardiserede mekanisk stimulation også drøftet.
Introduction
Smerter og overfølsomhed er de fremherskende klager fra patienter, der lider af funktionelle gastrointestinale sygdomme, herunder irritabel tarmsyndrom (IBS), som findes i fravær af tilsyneladende patobiologiske årsag eller vævsskade. For eksempel IBS patienter udviser overfølsomhed, herunder øgede responser til rektal ballon distension og øget følsomhed under normal tarmfunktion samt overfølsomhed af somatisk henvisning (dvs. ømhed til palpering af maveregionen) 1. Fordi målretning kolorektale afferente har vist sig at være effektive til at lindre smerter og overfølsomhed i IBS patienter (fx intra-rektal instillation af lokalanæstetika 2,3; oral indtagelse af guanylatcyklase-C agonist linaclotide 4-6), forbedret forståelse af afferent innervation af colorectum er vigtig.
Visceral afferente, herunder kolorektal afferenterEr i stand til at reagere på kemiske / næringsstof- og termiske modaliteter (fx 7-9). Imidlertid har viscerale afferente reagerer på mekaniske stimuli (dvs. mekanosensitive afferente) været den mest grundigt undersøgt, fordi mekaniske påvirkning (f.eks luminale udspiling, stretch) er dem, der generelt giver anledning til bevidste fornemmelser, herunder ubehag og smerte 10-16. Desuden er organerne også innerveret ved mekanisk ufølsomme afferenter (MIA), almindeligvis betegnet tavse eller sovende nociceptorer 17. Under normale fysiologiske betingelser, behøver Mias ikke reagere på mekanisk stimulation eller har meget høj respons tærskler 18, men kan blive aktive og erhverve mechanosensitivity i patofysiologiske tilstande og bidrage til overfølsomhed.
Brug af in vitro forberedelse og protokol beskrevet her, vi udviklet og anvendt en elektrisk stimulus strategi til søs RCH for modtagelige slutninger, tillader uvildig identifikation af både mekanosensitive og MIA slutninger i colorectum 19. Den kolorektal innervation stammer fra lumbal splanknisk (LSN) og bækken nerve (PN) veje, og omfatter kolorektal afferente, der kan kategoriseres i fem mekanosensitive klasser (serosale, mucosal, muskuløs, muskuløs-mucosal, mesenteriske) og en MIA klasse 20. Brug af denne in vitro forberedelse, fandt vi, at colorektale MIA erhvervet mechanosensitivity (sensibilisere) efter kort eksponering af deres receptive felter til en inflammatorisk suppe (IS), som sensibiliserede 71% af MIA i PN-vejen og 23% af MIA i LSN pathway 19. Vi dokumenteret også langsigtede sensibilisering (op til 28 dage) af MIA i forbindelse med langvarig adfærdsmæssige visceral overfølsomhed (dvs. i mus, der modtog intracolon behandlinger med zymosan 21 eller 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBS) 22) .
jove_content "> Blandt mekanosensitive afferente, muskuløs og muskuløs-slimhindeirriterende afferenter er de eneste klasser, tonisk koder periferisk strækning af colorectum (dvs. er stretch-sensitive) og subserve kodningen af skadelige colorectal udspiling 23,24. Ved hjælp af en computerstyret kraft aktuator anvendte vi en standard, homogent, og reproducerbar ramped stræk i den rundtgående retning af fladtrykt colorectal væv og yderligere kategoriseret stræk-sensitive afferenter med lav tærskel og høj tærskel 23. Desuden tidsforløbet for sensibilisering af stræk -følsom afferenter efter intracolon zymosan 21 eller TNBS 22 behandling svarer til udbrud, vedholdenhed, og / eller nyttiggørelse af adfærdsmæssige visceral hypersensitivitet, hvilket tyder på en rolle stræk-følsom kolorektale afferenter i visceral smerte og overfølsomhed.Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro colorectum-nerve præparat beskrevet her har vist sig at være en kraftig fremgangsmåde til at studere neurale koder funktioner individuelle colorektale afferenter, som pænt supplerer andre ikke-funktionelle metoder (f.eks, cellulære, molekylære og histologiske undersøgelser) på viscerale sensoriske neuroner ( se gennemgang 27 for detaljer). Neuronale mekanismer, der bidrager til nociception og langsigtet kolorektal overfølsomhed er blevet afsløret og farmakologiske manipula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
| Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
| Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
| Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
| Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
| forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | forceps with fine tips |
References
- Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
- Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients. Pain. 105, 223-230 (2003).
- Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).
- Chey, W. D., et al. Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety. Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).
- Rao, S., et al. A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation. Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).
- Busby, R. W., et al. Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation. J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).
- Mei, N. Intestinal chemosensitivity. Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).
- Mei, N., Lucchini, S. Current data and ideas on digestive sensitivity. J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).
- Su, X., Gebhart, G. F. Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character. J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).
- McMahon, S. B., Morrison, J. F. Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat. J Physiol. 322, 1-20 (1982).
- Cervero, F., Sann, H. Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig’s ureter: an in vitro study. J Physiol. 412, 245-266 (1989).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat. J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat. J Physiol. 425, 545-562 (1990).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder. Agents Actions. 25, 219-221 (1988).
- Brierley, S. M., Jones, R. C., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).
- Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey. Brain Res. 561, 252-261 (1991).
- Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat. J Physiol. 435, 229-242 (1991).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).
- Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).
- Feng, B., et al. Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).
- Feng, B., et al. Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).
- Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).
- Jolliffe, I. T. . Principal component analysis. , (2002).
- La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).
- Christianson, J. A., et al. plasticity and modulation of visceral afferents. Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).
- Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).
- Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).
- Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse. Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).
- Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).
