في المختبر توصيف الوظيفي للماوس القولون والمستقيم وارد النهايات
Summary
This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.
Abstract
يوضح هذا الفيديو بالتفصيل في المختبر، واحد من الألياف الكهربية بروتوكول تسجيل باستخدام إعداد الماوس القولون العصب. النهج يسمح بتحديد وتوصيف وظيفي متحيز من afferents القولون والمستقيم الفردية. التسجيلات خارج الخلية من إمكانات العمل نشر (الجزائرية) التي تنشأ من واحد أو عدد قليل من وارد (أي الألياف واحد) مصنوعة حقول تقبلا (علوم الاحياء) في القولون من مازحت كراسات الألياف العصبية. تتم إزالة القولون مع أي من الحوض (PN) أو قطني حشوي (LSN) العصبية المرفقة وفتحت طوليا. يتم وضع الأنسجة في غرفة تسجيل، دبس شقة ومع perfused حل كريبس الاوكسيجين. يستخدم التحفيز الكهربائي البؤري لتحديد النهايات وارد القولون والمستقيم، والتي يتم اختبارها مزيدا من ثلاثة محفزات الميكانيكية مميزة (ثلم التحقيق، التمسيد المخاطية وتمتد كفافي) لتصنيف وظيفيا في afferents إلى خمس mechanosensiدروس موانع. وتصنف النهايات الاستجابة لأيا من هذه المحفزات الميكانيكية وafferents ميكانيكيا-حساسة (المفقودين). كلا mechanosensitive ويمكن تقييم المفقودين لتوعية (أي استجابة محسنة، خفضت عتبة، و / أو حيازة mechanosensitivity) من خلال التعرض المترجمة من علوم الاحياء للمواد الكيميائية (مثل حساء التهابات (IS)، كشافات، أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)). وصفنا المعدات والقولون العصب إعداد تسجيل، والحصاد من القولون مع PN المرفقة أو LSN، وتحديد علوم الاحياء في القولون، الألياف واحد من تسجيل كراسات العصبية، وتطبيق المترجمة من المواد الكيميائية إلى RF. وبالإضافة إلى ذلك، وتناقش أيضا تحديات إعداد وتطبيق التحفيز الميكانيكي موحد.
Introduction
الألم وفرط الحساسية هي السائدة الشكاوى من المرضى الذين يعانون من اضطرابات الجهاز الهضمي الوظيفية، بما في ذلك متلازمة القولون العصبي (IBS)، والتي توجد في حالة عدم وجود سبب واضح pathobiological أو تلف الأنسجة. على سبيل المثال، والمرضى IBS تظهر فرط الحساسية، بما في ذلك ردود مشددة على المستقيم انتفاخ البالون وزيادة الحساسية خلال وظيفة الأمعاء الطبيعية، فضلا عن فرط الحساسية الإحالة الجسدية (أي، والحنان لملامسة للمنطقة البطن) 1. بسبب استهداف afferents القولون والمستقيم وقد ثبت أن تكون فعالة في تخفيف الألم وفرط الحساسية لدى مرضى القولون العصبي (على سبيل المثال، تقطير داخل المستقيم من التخدير الموضعي 2،3، ابتلاع الشفوي للguanylate محلقة-C ناهض linaclotide 4-6)، وتحسين فهم تعصيب وارد من القولون هو المهم.
afferents الحشوية، بما في ذلك afferents القولون والمستقيم، تكون قادرة على الاستجابة لطرائق الكيميائية / بالمغذيات والحرارية (على سبيل المثال، 7-9). ومع ذلك، فإن afferents الحشوية الاستجابة للمؤثرات الميكانيكية (أي afferents mechanosensitive) ودرس الأكثر بدقة بسبب المحفزات الميكانيكية (على سبيل المثال، وانتفاخ اللمعية، وتمتد) هي تلك التي ينتج عنها عادة الأحاسيس واعية، بما في ذلك الانزعاج والألم 10-16. وبالإضافة إلى ذلك، يتم معصب الأحشاء أيضا afferents حساسة ميكانيكيا (المفقودين)، عادة يطلق nociceptors الصامتة أو النوم 17. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية، المفقودين لا تستجيب لالتحفيز الميكانيكي أو لديهم استجابة عالية جدا عتبات 18، ولكن يمكن أن تصبح نشطة واكتساب mechanosensitivity في ظروف الفيزيولوجية المرضية والمساهمة في فرط الحساسية.
عن طريق إعداد في المختبر، وبروتوكول الموصوفة هنا، قمنا بتطوير ويعمل استراتيجية التحفيز الكهربائية إلى البحر RCH لنهايات تقبلا، والسماح تحديد متحيز كل من النهايات mechanosensitive وMIA في القولون 19. ويستمد تعصيب القولون والمستقيم من حشوي قطني (LSN) والعصبية الحوض (PN) مسارات، ويتضمن afferents القولون والمستقيم والتي يمكن تصنيفها إلى خمسة فصول mechanosensitive (المصلي، الغشاء المخاطي، العضلات، والعضلات-المخاطية، المساريقي) وفئة واحدة MIA 20. باستخدام هذا المستحضر في المختبر، وجدنا أن المفقودين القولون والمستقيم mechanosensitivity المكتسب (توعية) بعد التعرض موجز لحقولهم تقبلا لالحساء التهابات (IS)، والذي توعية 71٪ من المفقودين في مسار PN و 23٪ من المفقودين في مسار LSN 19. ونحن كما وثقت توعية طويلة الأمد (تصل إلى 28 يوما) من المفقودين في سياق فرط الحساسية الحشوية السلوكي طويلة الأمد (أي في الفئران تلقي العلاجات intracolonic مع زيموزان 21 أو حامض 2،4،6-trinitrobenzenesulfonic (TNBS) 22) .
jove_content "> ومن بين afferents mechanosensitive، afferents العضلات والعضلات-المخاطية هي الطبقات الوحيدة التي تكود tonically تمتد كفافي من القولون (أي، هي امتداد حساسة) وأيد ترميز الضارة انتفاخ القولون والمستقيم 23،24. وباستخدام الكمبيوتر التي تسيطر عليها قوة المحرك، طبقنا معيار، متجانسة، وقابلة للتكرار تمتد رفعت في اتجاه كفافي من نسيج القولون والمستقيم بالارض وزيادة تصنيفها afferents حساسة تمتد كما منخفضة وعالية عتبة عتبة 23. وبالإضافة إلى ذلك، وبالطبع وقت توعية تمتد afferents -sensitive بعد زيموزان intracolonic 21 أو 22 TNBS العلاج يتوافق مع ظهور، والمثابرة، و / أو استرداد فرط الحساسية الحشوية السلوكي، مما يشير إلى دور حساس تمتد afferents القولون والمستقيم في الألم الحشوية وفرط الحساسية.Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ثبت في المختبر إعداد القولون العصب الموصوفة هنا أن يكون طريقة فعالة لدراسة وظائف ترميز العصبية من afferents القولون والمستقيم الفردية، التي تكمل بشكل جيد النهج غير وظيفية أخرى (على سبيل المثال، والدراسات الخلوية والجزيئية والنسيجية) على الخلايا العصبية ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
| Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
| Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
| Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
| Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
| forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | forceps with fine tips |
References
- Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
- Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients. Pain. 105, 223-230 (2003).
- Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).
- Chey, W. D., et al. Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety. Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).
- Rao, S., et al. A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation. Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).
- Busby, R. W., et al. Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation. J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).
- Mei, N. Intestinal chemosensitivity. Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).
- Mei, N., Lucchini, S. Current data and ideas on digestive sensitivity. J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).
- Su, X., Gebhart, G. F. Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character. J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).
- McMahon, S. B., Morrison, J. F. Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat. J Physiol. 322, 1-20 (1982).
- Cervero, F., Sann, H. Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig’s ureter: an in vitro study. J Physiol. 412, 245-266 (1989).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat. J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat. J Physiol. 425, 545-562 (1990).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder. Agents Actions. 25, 219-221 (1988).
- Brierley, S. M., Jones, R. C., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).
- Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey. Brain Res. 561, 252-261 (1991).
- Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat. J Physiol. 435, 229-242 (1991).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).
- Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).
- Feng, B., et al. Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).
- Feng, B., et al. Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).
- Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).
- Jolliffe, I. T. . Principal component analysis. , (2002).
- La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).
- Christianson, J. A., et al. plasticity and modulation of visceral afferents. Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).
- Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).
- Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).
- Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse. Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).
- Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).
