マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、
Summary
This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.
Abstract
このビデオでは、詳細に、マウスの大腸-神経準備を用いたin vitroの単繊維電気生理学的記録プロトコルを示しています。アプローチは公平な識別と個々の大腸求心性の機能解析を可能にします。 1または少数の求心性から生じる伝播し活動電位（APS）の細胞外記録は（ すなわち、単一ファイバ）大腸内受容野（RFS）はからかわ神経線維線維束から作られています。大腸は、骨盤（PN）または腰椎内臓（LSN）神経取り付けられており、縦方向に開いたのいずれかで削除されます。組織は、記録チャンバーに入れ、平らに固定し、酸素化クレブス溶液で灌流される。フォーカル電気刺激は、機能的に5 mechanosensiに求心性神経を分類するために、さらに三つの異なる機械的刺激によってテストされている大腸求心性終末を、（プロービング、粘膜なでると周ストレッチを鈍ら）を見つけるために使用されます電性のクラス。これらの機械的刺激のいずれにも応答エンディングは、機械的に小文字を区別しない求心性（MIAs）に分類される。機械受容およびMIAs両方は、化学物質へのRFの局所露光部（ 例えば、炎症性スープ（IS）、カプサイシン、アデノシン三リン酸（ATP））によって（ すなわち、強化された応答を低減閾値、および/ または機械的感受性の取得）感作のために評価することができる。私たちは、機器や結腸直腸-神経録音の準備、添付のPNまたはLSNと大腸の収穫、大腸内のRFの識別、神経線維束から単心記録、およびRFへの化学物質のローカライズされたアプリケーションを記述する。また、標準化された機械的な刺激の準備とアプリケーションの課題も議論されている。
Introduction
疼痛および過敏症が明らかに病理学的原因または組織損傷の非存在下で存在する過敏性腸症候群（IBS）を含む機能性胃腸障害に罹患している患者の主な不満である。例えば、IBS患者は、体の紹介（腹部の触診に、すなわち、圧痛）1の直腸バルーン膨満への応答を高め、正常な腸機能の間に感受性の増加、ならびに過敏を含む過敏症を呈する。大腸求心性神経を標的にすること（局所麻酔薬2,3の例、直腸内点滴注入、グアニル酸シクラーゼ-Cアゴニストリナクロチド4-6の経口摂取）をIBS患者の痛みや過敏症を緩和するのに有効であることが証明されているため、理解の向上大腸の求心性神経支配が重要です。
大腸求心性神経を含む内臓求心性神経、化学/ nutrient-および熱モダリティ（ 例えば、7-9）に応答することができる。機械的な刺激（ 例えば、管腔膨満、ストレッチ）は、一般的に不快感や痛み10-16含め意識的な感覚、を生じさせるものであるので、機械的刺激（ すなわち、機械受容求心性神経）への対応内臓求心性神経は、最も徹底的に研究されている。また、内臓はまた、一般的に、機械的に区別しない求心性（MIAs）によって神経支配サイレントまたは眠っ侵害受容器17と呼ばれている。正常な生理的条件下では、MIAsは機械的な刺激に応答したり、持っていない非常に高い応答が18をしきい値が、アクティブになり、病態生理学的状態において機械的感受性を取得し、過敏症に寄与することができる。
ここに記載のインビトロ調製およびプロトコルを使用して、我々は、海に電気刺激戦略を開発し、採用大腸19の両方の機械受容とMIA終末の公平な識別を可能に受容語尾のためRCH。結腸直腸の神経支配は腰部内臓（LSN）および骨盤神経（PN）経路に由来し、5機械受容クラス（漿膜、粘膜、筋肉、筋肉、粘膜、腸間膜）と一つMIAクラス20に分類することができる直腸求心性線維を含む。このインビトロ準備を使用して、我々は大腸MIAs獲得した機械的感受性がLSN経路においてPN経路におけるMIAsの71％とMIAsの23％増感炎症スープ（IS）、への受容野の簡単な露出以下（感作）ことがわかった19。また、（ザイモサン21または2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）22で結腸内処置を受けたマウス、すなわち、）長期間持続する行動内臓過敏の文脈でMIAsの（28日まで）の長期感作を文書化。
機械受容求心性神経のうちjove_content ">、筋肉と筋肉の粘膜求心性は持続的に大腸の周ストレッチをエンコード（ すなわち、ストレッチと小文字が区別されます）と有害な結腸直腸拡張23,24のエンコーディングを補助する唯一のクラスである。コンピュータ制御を使用して、フォースアクチュエータは、均質で、基準を適用し、かつ再現性が平坦化された大腸組織とさらに分類ストレッチセンシティブ求心低閾値および高閾値23の周方向に伸縮性を上げ、また、伸縮性の感作の時間経過を結腸内ザイモサン21またはTNBS 22治療後の感受性求心性内臓痛および過敏でストレッチに敏感な大腸求心性神経の役割を示唆し、行動内臓過敏の発症、持続性、および/ または回復に対応している。Protocol
Representative Results
Discussion
ここに記載のインビトロ結腸直腸神経準備がうまく内臓感覚ニューロン上の他の非機能的アプローチ（ 例えば 、細胞、分子、および組織学的研究）を補完する個々の結腸直腸求心性の神経エンコーディング機能（研究するための強力なアプローチであることが証明され）詳細についてはレビュー27を参照してください。痛覚および長期直腸過敏症に寄与神経メカニズム?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
| Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
| Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
| Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
| Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
| forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | forceps with fine tips |
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