Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven
Summary
Hier beschrijven we een werkwijze voor het remmen van genfunctie in ziektedragers muggen door het gebruik van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die worden opgenomen door larven.
Abstract
Vector muggen toebrengen meer menselijk lijden dan enig ander organisme – en doodt elk jaar meer dan een miljoen mensen. De mug genoom projecten gefaciliteerd onderzoek naar nieuwe facetten van mosquito biologie, met inbegrip van functionele genetische studies in de primaire Afrikaanse malaria vector Anopheles gambiae en de dengue en gele koorts vector Aedes aegypti. RNA-interferentie (RNAi-) gemedieerde gene silencing is gebruikt om genen van belang te richten in deze beide ziekteoverbrenger muggensoorten. Hier beschrijven we een werkwijze voor het bereiden van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die gecombineerd met voedsel en ingenomen door larven. Deze technisch eenvoudige, high-throughput en relatief goedkope methode, die verenigbaar met lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) of kleine interfererende RNA (siRNA) moleculen, is gebruikt voor de succesvolle knock-down van verschillende genen in A. gambiae en A. aegyptilarven. Na larvale voedingen, knock-down, dat wordt gecontroleerd door middel van qRT-PCR of in situ hybridisatie, kunnen aanhouden op zijn minst door de late popstadium. Deze methodologie kan voor allerlei muggen en andere insecten, waaronder landbouwongedierte, evenals andere niet-model organismen. Naast zijn bruikbaarheid bij het onderzoekslaboratorium, in de toekomst, chitosan, een goedkope, niet-toxisch en biologisch afbreekbaar polymeer, zou kunnen worden gebruikt in het veld.
Introduction
Bloed voeden vector muggen van de Anophelinen en Aedine geslachten overbrengen ziekteverwekkers verantwoordelijk voor enkele van de ergste bedreigingen van de mensheid. Naar schatting 3,4 miljard mensen het risico voor het oplopen van malaria, die verantwoordelijk is voor meer dan een half miljoen doden per jaar wereldwijd. Malaria resultaat van infectie door Plasmodium sp. Parasieten, die door beten van geïnfecteerde muggen van het geslacht Anopheles, inclusief de belangrijkste Afrikaanse vector Anopheles gambiae (mensen worden doorgegeven http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti mug de primaire vector voor dengue virus dat dengue koorts, een niet-specifieke koorts die de meest voorkomende en belangrijke arboviral ziekte in de wereld veroorzaakt. Dengue-virus is op dit moment een bedreiging voor> 2,5 miljard mensen in de tropen, met een jaarlijkse incidence van ongeveer 50 miljoen gevallen resulterend in ~ 24.000 sterfgevallen per jaar ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Ondanks de verwoestende wereldwijde impact van door muggen overgebrachte ziekten op de menselijke gezondheid, doeltreffende middelen ter voorkoming en behandeling van deze ziekten ontbreken. Mosquito controle is op dit moment de beste methode van ziektepreventie.
Het potentieel voor het regelen van geleedpotigen overgedragen ziekten door de genetische manipulatie van de vectoren is erkend voor meer dan vier decennia 3. Transgene stammen van A. aegypti ontworpen om een onderdrukbaar vrouwelijke-specifieke vliegende fenotype hebben onlangs het potentieel voor het gebruik van transgene vector controle strategieën een realiteit 4-6. Deze ontwikkelingen hebben de onderzoekers uitgedaagd om nieuwe genetische targets te identificeren voor vector controle en extra middel om het manipuleren van gen-functie in vector muggen. Wijziging van genexpressie dijdens de ontwikkeling, zoals het geval was bij vrouwelijke-vliegende muggen 4 was, kan de opheldering van nieuwe vector controle strategieën te bevorderen. Echter grotendeels door technische problemen, de functies van zeer weinig genen gekarakteriseerd tijdens de ontwikkeling van A. gambiae, A. aegypti, of andere muggensoorten.
Sinds zijn ontdekking in C. elegans 7, RNA interferentie (RNAi), die wordt bewaard in dieren, planten en micro-organismen, is uitgebreid gebruikt voor functionele genetische studies in diverse organismen, waaronder insecten 8,9. De RNAi route wordt geïnitieerd door Dicer, die splitst lange dsRNA in korte 20-25 nucleotide-lange siRNA's die functioneren als sequentie-specifieke interfererende RNA. siRNA stilte genen die complementair zijn in de juiste volgorde zijn door het bevorderen van transcript omzet, splitsing, en verstoring van de vertaling 9. Lange dsRNA moleculen (meestal 300-600 bp) of aangepaste siRNA gericht op een particular sequentie kan worden gebruikt in het onderzoekslaboratorium voor silencing elk gen van interesse. Door het beheer wanneer interfererende RNA is uitgebracht, kunnen onderzoekers de tijd te controleren op welk gen silencing ingewijden. Dit voordeel is nuttig als het kan worden gebruikt om problemen zoals ontwikkelingsstoornissen letaliteit of steriliteit, die de productie en het onderhoud van stammen dragende erfelijke mutaties, een duur en arbeidsintensief proces dat nog niet in alle insectensoorten kunnen belemmeren overwinnen. Hoewel de mate van gen silencing door RNAi varieert van gen tot gen, weefsel weefsel en dier tot dier, wordt RNAi veel gebruikt voor functionele analyse van genen in muggen en andere insecten 8,9.
Drie interfererende RNA levering strategieën zijn gebruikt muggen: micro-injectie, inweken / topische toediening, en inslikken. Voor een gedetailleerde geschiedenis en vergelijking van het gebruik van deze drie technieken bij insecten, verwijzen wij u naar Yu et al 8. We hebben met succes gebruik microinjectie 10 als een middel om siRNAs ontwikkelingsstoornissen genen in A. targeten aegypti embryo's, larven en poppen 11-14. Echter, dit arbeidsintensieve levering strategie vereist zowel een micro-injectie setup en een bedreven hand. Bovendien microinjectie is belastend het organisme, een verstorende factor, vooral wanneer gedrags fenotypen worden beoordeeld. Tenslotte kan microinjectie levering niet worden uitgebreid tot het veld vectorcontrole. Als alternatief, onderdompelen het organisme interfererende RNA oplossing ook een populaire manier induceren gene silencing, aangezien het gemakkelijk en vergt weinig of arbeid. Doorwekende heeft hoofdzakelijk insectencellijn toegepast bestudeert 8, maar in een recente studie werd knockdown in A. bereikt aegypti larven ondergedompeld in een oplossing van dsRNA 15, die de dieren leek te inname. Voor studies met analyse van veelvoudige experimental groepen of fenotypes, inweken is nogal kostbaar. Lopez-Martinez et al. 16 beschreven rehydratie gedreven RNAi, een nieuwe benadering voor interfererende RNA aflevering dat uitdroging in zoutoplossing en rehydratie gaat met een enkele druppel water met interfererende RNA. Deze benadering knipt de kosten geheel dier onderdompeling, maar is duurder dan micro-injectie en kan de toepassing ervan soorten die hoge osmotische druk kan verdragen beperkt. Bovendien is het moeilijk voor te stellen hoe onderdompeling of dehydratatie / rehydratatie onderdompeling methode kan worden aangepast voor vectorcontrole in het veld. Daarom, voor post-embryonale studies, levering van interfererende RNA met voedsel ingenomen een levensvatbare alternatieve strategie.
Alhoewel-inname gebaseerde strategieën werken niet in alle insectensoorten, misschien wel het meest bijzonder Drosophila melanogaster, is orale toediening van interfererende RNA gemengd met voedsel gen si bevorderdlencing in verschillende insecten 8,17, waaronder A. aegypti volwassenen 18. We beschreven chitosan-nanodeeltjes gemedieerde RNAi in A. gambiae larven 19 en hebben met succes toegepast deze aanpak voor de vermindering van de genexpressie in A. aegypti larven 20,21. Hier, methodologie voor deze RNAi procedure, wat inhoudt dat het insluiten van interfererende RNA door het polymeer chitosan, is gedetailleerd. Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes worden gevormd door zelf-assemblage van polykationen met interfererende RNA via elektrostatische krachten tussen de positieve ladingen van de aminogroepen van chitosan en negatieve ladingen op de hoofdketen van interfererende RNA 19 van het fosfaat groepen. De beschreven werkwijze is geschikt voor zowel lange dsRNA moleculen (hierna dsRNA) of dubbelstrengs siRNA (hierna siRNA). Na synthese, chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemengd met larven eten en afgeleverdlarven bij inslikken. Deze methode is relatief goedkoop, vereist weinig apparatuur en arbeid 19, en faciliteert high-throughput analyse van meerdere fenotypes, met inbegrip van de analyse van het gedrag 20,21. Deze methode, die kan worden aangepast voor gen-silencing studies in andere insecten, waaronder andere vectoren ziekte en insecten landbouwongedierte, zou kunnen worden gebruikt voor gen-silencing in een verscheidenheid van andere diersoorten. Bovendien, chitosan, een goedkope, niet-toxisch en biologisch afbreekbaar polymeer 22, zou kunnen worden gebruikt in het veld soortspecifieke muggen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes hierin beschreven methode werd gebruikt om effectief genen richten tijdens de larvale ontwikkeling A. gambiae (figuren 2, 3) en A. aegypti (figuren 4, 5, 6, Tabellen 1, 2). Chitosan nanodeeltjes kunnen worden bereid met ofwel lange dsRNA of siRNA, die beide met succes gebruikt in muggen zoals blijkt uit de representatieve resultaten hierin beschreven. Synthese van dsRNA goedkoper dan de aankoop siRNA, maar is arbeidsintensi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
References
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
- Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
- Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
- Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
- Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
- Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
- Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
- Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
- Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
- Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
- An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
- Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).
- Haugen, M., et al. . Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
- Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
- Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
- He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
- Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
- Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
- Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
