질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거
Summary
여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.
Abstract
벡터 모기는 다른 생물보다 더 인간의 고통을 입힐 – 이상 백만명 매년 죽인다. 모기 게놈 프로젝트는 기본 아프리카 말라리아 벡터과 아노 펠 레스 gambiae 및 뎅기열과 황열병 벡터 Aedes aegypti의 유전학적인 연구를 포함하여 모기 생물학의 새로운 측면에서 연구를 촉진. RNA 간섭 – (RNAi-) 매개 유전자 침묵은 이러한 질병 벡터 모기 종 모두에 대한 관심의 유전자를 대상으로 사용되어왔다. 여기서는 음식 합하고 유충 섭취 RNA 간섭 나노 입자 / 키토산의 제조 과정을 설명한다. 긴 이중 가닥 RNA (dsRNA에) 또는 작은 간섭 RNA (siRNA의) 분자와 호환이 기술적으로 간단 높은 처리량 및 비교적 저렴한 방법은, A. 다른 유전자의 숫자의 성공적인 최저 사용되어왔다 gambiae 및 A. aegyptiQRT-PCR을 통해 또는 현장 하이브리드에 확인 유충. 애벌레의 먹이에 따라, 최저는, 적어도 후반 번데기를 유지할 수 있습니다. 이 방법론은 모기 및 농업 해충 곤충을 포함하는 다른 종의 다양한뿐만 아니라 다른 비 유기체 모델에 적용될 수있다. 연구 실험실에서 유용성 외에도 향후, 키토산, 저렴하고, 비 독성 및 생분해 성 중합체, 잠재적 분야에서 이용 될 수있다.
Introduction
Anopheline과 Aedine 장군의 혈액 공급 벡터 모기는 인류 최악의 재앙의 몇 가지에 대한 책임 질병을 유발하는 에이전트를 전송합니다. 추정 34억명는 매년 전 세계에 걸쳐 절반 만 죽음에 대한 책임이 말라리아, 계약에 대한 위험이 있습니다. 말라리아 특검팀에 의해 감염 말라리아 결과. 주요 아프리카 벡터과 아노 펠 레스 gambiae (를 포함하여 얼룩 날개 속의 감염된 모기의 물린 상처를 통해 사람에게 전송되는 기생충, http://www.who.int/topics/malaria/en/ 2014) 1. Aedes aegypti는 뎅기열, 세계에서 가장 광범위하고 중요한 arboviral 질병 비특이적 열성 질환을 일으키는 뎅기 바이러스에 대한 기본 모기 벡터이다. 뎅기열 바이러스는 매년 inciden으로, 현재 열대> 25억명에 대한 위협이다24,000 사망자 매년 ~의 결과로 약 5천만가지 경우의 CE ( http://www.cdc.gov/dengue/ 2014) 2. 인간의 건강에 모기 매개 질병의 파괴적인 글로벌 충격에도 불구하고, 예방 및 질병 치료의 효과적인 수단이 부족하다. 모기 제어는 현재 질병 예방의 가장 좋은 방법입니다.
벡터 곤충의 유전자 조작에 의해 절지 동물 매개 질병을 제어하기위한 잠재력은 지난 4 년간 3 인정을 받고있다. A.의 형질 전환 균주 최근 형질 전환 벡터 제어 전략을 현실로 4-6를 사용하기위한 가능성을 만든 aegypti repressible 여성 고유의 날지 표현형을 가지고 설계. 이러한 발전은 벡터 및 벡터 제어 모기 유전자 기능을 조작하기위한 수단을 추가로 신규 한 유전자 표적을 식별하기 위해 연구에 도전했다. 유전자 발현 (D)의 변경을여성이 날지 모기 4의 경우가 있다는 uring 개발, 새로운 벡터 제어 전략의 해명을 촉진 할 수있다. 그러나, 대부분 기술적 과제를 극소수의 유전자 기능의 개발 과정 A. 특성화되었다 gambiae, A. aegypti의, 또는 다른 모기 종.
C.에서의 발견 이후 엘레 7은, 동물, 식물, 미생물에 보존되는 RNA 간섭 (RNAi에)는, 광범위 곤충 8,9 포함한 생물체의 다양한, 기능성 유전 연구에서 사용되어왔다. RNAi의 경로는 순서 특정 간섭 RNA의 기능을 짧은 20 ~ 25 염기 길이의 siRNA를로 다이 서 (Dicer), 절단 긴 dsRNA에 의해 시작됩니다. 성적 증명서 회전율, 분열, 번역 (9)의 중단을 촉진하여 순서에 상보적인 siRNA를 침묵 유전자. particula을 대상으로 긴 dsRNA를 분자 (일반적으로 300 ~ 600 BP) 또는 사용자 정의 된 siRNAR 열은 임의의 관심있는 유전자 사일런 싱에 대한 연구 실험실에서 사용될 수있다. RNA가 전달을 방해 할 때 관리함으로써, 연구진은 유전자에 동수를 침묵 시간을 제어 할 수 있습니다. 그것은 생산과 유전적인 돌연변이, 아직 모든 곤충 종에 존재하지 않는 비용과 노동 집약적 인 프로세스를 베어링 균주의 유지를 방해 할 수 있습니다 이러한 발달 치사 또는 불임 등의 문제를 극복하는 데 사용할 수있는 이러한 장점에 유용합니다. RNAi에 의한 유전자 침묵의 과정은 동물에게 유전자를 조직의 조직 및 동물 유전자에서 달라질 수 있지만, RNAi를 널리 모기 및 다른 곤충 8,9에서 유전자의 기능 분석을 위해 사용된다.
세 간섭 RNA 배달 전략은 모기에 사용되었습니다 미세 주사, 전신 / 국소 응용 프로그램 및 섭취. 자세한 역사와 곤충이 세 가지 기술의 사용의 비교를 위해, 유 등의 알 8을 참조하시기 바랍니다. WE 성공적 A.에서 발달 유전자를 표적으로 siRNA를 전달하는 수단으로서 마이크로 인젝션 10을 사용한 aegypti 배아, 유충, 번데기 11-14. 그러나이 노동 집약적 인 배달 전략은 미세 주사 설정 및 숙련 된 손 모두를 필요로한다. 또한, 미세 주입은 행동 표현형이 부과됩니다 특히, 생물, 교란 요인에 스트레스. 마지막으로, 마이크로 인젝션 배달 벡터 제어를위한 필드로 확장 될 수 없다. 편리하고 작은 장비 또는 노동을 필요로하는 대신, RNA 간섭을 용액에 담그는 유기체 또한, 유전자 침묵을 유도하는 인기 수단이되었다. 잠기기는 주로 곤충 세포 라인에 적용된 것은 8을 연구하지만, 최근의 연구에서, 최저는 A에 달성되었다 aegypti 유충 동물이 섭취하는 dsRNA 것으로 나타났다 (15)의 용액에 침지. 그러나, 여러 experimenta의 분석과 관련된 연구L 그룹이나 표현형은 몸을 담근 채 오히려 비용이 많이 든다. 로페즈 마르티네스 등. 16의 RNAi, RNA 간섭을 함유하는 물을 한 방울과 식염수 탈수 재수 관련된 RNA 전달을 방해하기위한 새로운 접근 방식을 재수 구동을 설명했다. 이 접근법은 전체 동물의 침지와 관련된 비용을 절감하지만 미세 주입보다 더 비싼 높은 삼투압을 허용 할 수있는 종의 적용이 제한 될 수있다 않는다. 또한, 침지 또는 탈수 / 재수 침지 방법이 필드 벡터 제어하도록 적응 될 수있는 방법을 구상하는 것이 곤란하다. 이런 이유로, 이후의 배아 연구를 들면 음식 섭취 RNA 간섭의 배달 대안 전략이다.
섭취 기반 전략이 모든 종의 곤충, 아마도 특히 초파리에서 작동하지 않지만, 음식과 혼합 RNA 간섭의 구두 전달은 유전자의시를 승진시켰다곤충 8,17의 다양한 lencing 포함 A. aegypti 성인 18. 우리는 A에 키토산 나노 입자 매개 RNAi의 설명 gambiae 유충 (19) 성공적으로 A의 유전자 발현의 감소를위한이 방법을 적용했습니다 aegypti 애벌레 (20, 21). 여기서, 고분자 키토산 RNA 간섭의 포획이 포함 RNAi의 절차를위한 방법은, 상세하다. 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 키토산의 아미노기의 양전하와 RNA 19 간섭의 백본에 인산기에 의해지지 마이너스 전하 사이의 정전기력을 통해 RNA 간섭과 폴리 양이온의 자기 조립에 의해 형성된다. 설명 된 절차는 긴 dsRNA를 분자 (이하의 siRNA로 지칭)을 가닥의 siRNA (이하 dsRNA를 라 함) 또는 이중 모두와 호환된다. 다음 합성, 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자는 애벌레 음식과 혼합에게 전달됩니다경구 섭취를 통해 유충. 이 방법론은, 비교적 저렴 작은 장비 및 인력 (19)이 필요하며, 동작 (20, 21)의 분석을 포함하는 다수의 표현형의 높은 처리량 분석을 용이하게한다. 다른 질병 벡터 및 곤충 농업 해충 포함한 다른 곤충에서 유전자 침묵 과정에 대해 적응 될 수있다이 방법은, 잠재적으로 다른 동물 종의 다양한 유전자 침묵을 위해 사용될 수있다. 또한, 키토산, 저렴 무독성 생분해 성 고분자 (22)는 잠재적으로 종 특이 모기 제어를위한 분야에서 이용 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본원에 기술 된 키토산 / RNA 간섭 나노 방법론 효과적으로 A.에서 유생 중에 유전자를 대상으로 사용되어왔다 gambiae (도 2, 3) 및 A. aegypti (도 4, 5, 6, 표 1, 2). 키토산 나노 입자는 본원에 기재된 대표적인 결과에 의해 입증되는 바와 같이 모기에서 성공적으로 사용되어왔다 둘 또는 긴 dsRNA에 siRNA를, 어느 제조 될 수있다. dsRNA에의 합성 siRNA를 구매보다 저?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
References
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
- Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
- Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
- Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
- Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
- Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
- Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
- Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
- Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
- Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
- An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
- Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).
- Haugen, M., et al. . Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
- Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
- Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
- He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
- Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
- Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
- Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
