El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos
Summary
Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.
Abstract
Mosquitos vectores infligen más sufrimiento humano que cualquier otro organismo – y matan a más de un millón de personas cada año. Los proyectos del genoma del mosquito facilitaron la investigación en nuevas facetas de la biología de los mosquitos, incluidos estudios genéticos funcionales en el principal vector de la malaria Anopheles gambiae africana y el dengue y la fiebre amarilla vector Aedes aegypti. ARN de interferencias (RNAi-) mediada por el silenciamiento de genes se ha utilizado para dirigir genes de interés en ambas de estas especies de mosquitos vectores de enfermedades. Aquí se describe un procedimiento para la preparación de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que se combinan con los alimentos y ingeridos por las larvas. Este técnicamente sencilla, de alto rendimiento, y la metodología relativamente barato, que es compatible con una larga ARN de doble cadena (dsRNA) o pequeños ARN de interferencia (siRNA) moléculas, se ha utilizado para la caída con éxito de un número de diferentes genes en A. gambiae y A. aegyptilarvas. Siguiendo la alimentación de larvas, desmontables, que se verifica a través de QRT-PCR o hibridación in situ, pueden persistir por lo menos a través de la fase de pupa tarde. Esta metodología puede ser aplicable a una amplia variedad de mosquitos y otras especies de insectos, incluyendo las plagas agrícolas, así como otros organismos no modelo. Además de su utilidad en el laboratorio de investigación, en el futuro, quitosano, un polímero barato, no tóxico y biodegradable, podría potencialmente ser utilizada en el campo.
Introduction
Los mosquitos se alimentan de sangre de vectores de los géneros anofelinos y Aedine transmiten agentes patógenos responsables de varios de los peores flagelos de la humanidad. Se estima que unos 3,4 mil millones de personas están en riesgo de contraer la malaria, que es responsable de más de medio millón de muertes al año en todo el mundo. Resultados de la malaria de la infección por Plasmodium sp. Parásitos, que se transmiten al ser humano por la picadura de mosquitos infectados del género Anopheles, incluyendo el vector africano director Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti es el mosquito vector primario para el virus del dengue, que causa la fiebre del dengue, una enfermedad febril inespecífica que es la enfermedad por arbovirus más extendida e importante en el mundo. El virus del dengue es actualmente una amenaza a> 2,5 mil millones de personas en los trópicos, con una inciden anualce de aproximadamente 50 millones de casos con resultado de ~ 24.000 muertes al año ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. A pesar del impacto mundial devastadora de enfermedades transmitidas por mosquitos en la salud humana, medio eficaz de prevención y tratamiento de estas enfermedades son escasas. El control de mosquitos es actualmente el mejor método de prevención de enfermedades.
El potencial para el control de enfermedades transmitidas por artrópodos por la manipulación genética de los insectos vectores ha sido reconocido por más de cuatro décadas 3. Cepas transgénicas de A. aegypti diseñados para tener un volador fenotipo femenino específico represible han hecho recientemente la posibilidad de utilizar las estrategias de control de vectores transgénicos una realidad 4-6. Estos avances han desafiado a los investigadores a identificar dianas genéticas novedosas para el control de vectores y otros medios de manipulación de genes en función de los mosquitos vectores. La alteración de la expresión génica durante el desarrollo, como fue el caso en las mujeres no volador mosquitos 4, puede promover el esclarecimiento de las estrategias de control de vectores novedosos. Sin embargo, en gran parte debido a las dificultades técnicas, las funciones de muy pocos genes se han caracterizado durante el desarrollo de A. gambiae, A. aegypti, o de otras especies de mosquitos.
Desde su descubrimiento en C. elegans 7, RNA de interferencia (RNAi), que se conserva en los animales, plantas y microorganismos, se ha utilizado ampliamente para estudios genéticos funcionales en una amplia variedad de organismos, incluyendo insectos 8,9. La vía de RNAi se inicia por Dicer, que escinde largo dsRNA en 20-25 siRNAs cortos-nucleótidos de largo que funcionan como ARN de interferencia específico de secuencia. genes silencio siRNAs que son complementarias en la secuencia mediante la promoción de rotación de transcripción, escote, y la interrupción de la traducción 9. Largas moléculas de dsRNA (típicamente 300-600 pb) o siRNAs personalizadas dirigidas a una particulasecuencia r se puede utilizar en el laboratorio de investigación para silenciar cualquier gen de interés. Mediante la gestión de ARN de interferencia cuando se entrega, los investigadores pueden controlar el tiempo en el que el silenciamiento de genes iniciados. Esta ventaja es útil, ya que se puede utilizar para superar retos como la letalidad del desarrollo o la esterilidad, lo que puede dificultar la producción y mantenimiento de cepas con mutaciones hereditarias, un proceso costoso y laborioso que aún no está disponible en todas las especies de insectos. Aunque el grado de silenciamiento génico por RNAi puede variar de un gen a gen, tejido a tejido, y un animal a otro, RNAi es ampliamente utilizado para el análisis funcional de los genes en los mosquitos y otros insectos 8,9.
Tres estrategias de entrega de interferencia de ARN se han utilizado en los mosquitos: la microinyección, la aplicación de remojo / tópica, y la ingestión. Para una historia detallada y comparación del uso de estas tres técnicas en los insectos, consulte Yu et al 8. We han utilizado con éxito microinyección 10 como un medio de entrega de siRNAs para dirigir genes de desarrollo en A. aegypti embriones, larvas y pupas 11-14. Sin embargo, esta estrategia de prestación de mano de obra intensiva requiere tanto una configuración de microinyección y una mano experta. Por otra parte, la microinyección es estresante para el organismo, un factor de confusión, en particular cuando se evaluarán fenotipos conductuales. Por último, la entrega microinyección no puede extenderse al campo para el control de vectores. Como alternativa, empapando el organismo en interferir solución de ARN también se ha convertido en un medio popular para inducir el silenciamiento de genes, ya que es conveniente y requiere poco equipo o el trabajo. El remojo principalmente se ha aplicado en la línea celular de insecto estudia 8, pero en un estudio reciente, desmontables se logró en A. aegypti sumerge en una solución de dsRNA 15, que los animales parecían estar ingerir. Sin embargo, para los estudios con análisis de múltiples Experimentagrupos l o fenotipos, remojo es bastante costoso. López-Martínez et al. 16 describe la rehidratación impulsado RNAi, un nuevo enfoque para la entrega de ARN de interferencia que implica la deshidratación en solución salina y la rehidratación con una sola gota de agua que contiene ARN de interferencia. Este enfoque no corta los costos asociados con la inmersión de animal completo, pero es más caro que la microinyección y puede ser limitada en su aplicación a las especies que pueden tolerar altas presiones osmóticas. Por otra parte, es difícil imaginar cómo la inmersión o la metodología de inmersión / rehidratación deshidratación podrían ser adaptados para el control de vectores en el campo. Por estas razones, para estudios post-embrionarias, la entrega de ARN de interferencia con los alimentos ingeridos es una estrategia alternativa viable.
Aunque las estrategias basadas en la ingestión no funcionan en todas las especies de insectos, tal vez sobre todo Drosophila melanogaster, la administración oral de ARN de interferencia se mezcla con los alimentos ha promovido si genlencing en una variedad de insectos 8,17, incluyendo A. aegypti adultos 18. Describimos quitosano nanopartículas mediada RNAi en A. larvas gambiae 19 y se han aplicado con éxito este enfoque para la reducción de la expresión de genes en A. Aegypti 20,21. Aquí, la metodología para este procedimiento RNAi, que implica el atrapamiento del ARN de interferencia por el quitosano polímero, es detallada. Chitosan / interferencia de ARN nanopartículas están formadas por autoensamblaje de policationes con ARN de interferencia a través de las fuerzas electrostáticas entre las cargas positivas de los grupos amino en el quitosán y las cargas negativas llevadas por los grupos fosfato en la cadena principal de ARN de interferencia 19. El procedimiento descrito es compatible con las moléculas de ARN de doble cadena larga (en adelante como dsRNA) o doble cadena siRNA (en lo sucesivo, siRNA). Después de la síntesis, quitosano / interferencia nanopartículas de ARN se mezclan con el alimento de las larvas y se entregan alarvas a través de la ingestión oral. Esta metodología es relativamente barato, requiere poco equipo y mano de obra 19, y facilita el análisis de alto rendimiento de múltiples fenotipos, incluyendo el análisis de los comportamientos de 20,21. Esta metodología, que puede ser adaptado para estudios de silenciamiento de genes en otros insectos, incluyendo otros vectores de enfermedades y plagas de insectos agrícolas, lo que potencialmente podría ser utilizado para el silenciamiento de genes en una variedad de otras especies animales. Además, el quitosano, un polímero barato, no tóxico y biodegradable 22, lo que potencialmente podría ser utilizado en el campo para el control de mosquitos específico de la especie.
Protocol
Representative Results
Discussion
El / interferir metodología de nanopartículas de quitosano ARN descrito en este documento se ha utilizado para dirigir eficazmente genes durante el desarrollo larval en A. gambiae (Figuras 2, 3) y A. aegypti (Figuras 4, 5, 6, los cuadros 1, 2). Nanopartículas de quitosano pueden ser preparadas con cualquiera de largo dsRNA o siRNA, ambos de los cuales se han utilizado con éxito en los mosquitos como se evidencia por los resultados representativos descritos en el pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
References
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
- Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
- Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
- Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
- Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
- Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
- Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
- Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
- Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
- Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
- An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
- Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).
- Haugen, M., et al. . Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
- Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
- Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
- He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
- Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
- Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
- Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
