Biofunctionalized bleu de Prusse nanoparticules pour l'imagerie moléculaire multimodale Applications
Summary
This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.
Abstract
Multimodal, l'imagerie moléculaire permet la visualisation des processus biologiques à des résolutions cellulaires, subcellulaires, et au niveau moléculaire en utilisant plusieurs techniques d'imagerie, complémentaires. Ces agents d'imagerie facilitent l'évaluation en temps réel des voies et mécanismes in vivo, qui améliorent à la fois l'efficacité diagnostique et thérapeutique. Cet article présente le protocole pour la synthèse de nanoparticules bleu de Prusse biofunctionalized (PB PN) – une nouvelle classe d'agents pour une utilisation dans des applications multimodales, d'imagerie moléculaire. Les modalités d'imagerie incorporé dans les nanoparticules, l'imagerie par fluorescence et l'imagerie par résonance magnétique (IRM), ont des caractéristiques complémentaires. Les IP PB possèdent une conception noyau-enveloppe où le gadolinium et des ions manganèse incorporés dans les espaces interstitiels du treillis PB génèrent contraste IRM, à la fois en T 1 et T 2 pondérées en séquences. Les IP PB sont revêtues d'avidine fluorescent à l'aide électrostatique comme auto-Assemblée, qui permet l'imagerie de fluorescence. Les nanoparticules revêtues d'avidine sont modifiés avec des ligands biotinylés qui confèrent des capacités de ciblage moléculaire aux nanoparticules. La stabilité et la toxicité des nanoparticules sont mesurées, ainsi que leurs relaxivité d'IRM. Les capacités multimodales, d'imagerie moléculaire de ces IP PB biofunctionalized sont ensuite démontrées par leur utilisation pour l'imagerie de fluorescence et l'IRM moléculaire in vitro.
Introduction
L'imagerie moléculaire est la visualisation non invasive et ciblée des processus biologiques au niveau cellulaire, subcellulaire et une échelle moléculaire. L'imagerie moléculaire permet un spécimen de rester dans son microenvironnement native tandis que ses voies et mécanismes endogènes sont évalués en temps réel. Typiquement, l'imagerie moléculaire implique l'administration d'un agent d'imagerie exogène sous la forme d'une petite molécule, macromolécule, ou nanoparticules de visualiser, cible, et de tracer les processus physiologiques pertinents étudié deux. Les différentes modalités d'imagerie qui ont été explorées en imagerie moléculaire comprennent l'IRM, CT, PET, SPECT, ultrasons, photoacoustique, la spectroscopie Raman, la bioluminescence, fluorescence et microscopie intravitale 3. Imagerie multimodale est la combinaison de deux ou plusieurs modalités d'imagerie où la combinaison améliore la capacité de visualiser et de caractériser les différents processus et des événements biologiques 4. Multimodal imagerie exploite les forces des techniques d'imagerie individuels, tout en compensant leurs limitations individuelles 3.
Cet article présente le protocole pour la synthèse de nanoparticules bleu de Prusse biofunctionalized (PB PN) – une nouvelle classe d'agents d'imagerie multimodaux, moléculaires. Les IP PB sont utilisés pour l'imagerie de fluorescence et l'IRM moléculaire. PB est un pigment constitué d'une alternance de fer (II) et de fer (III) des atomes dans un réseau cubique à faces centrées (figure 1). Le treillis est composé de PB de ligands cyanure linéaires dans un Fe II – CN – liaison Fe III qui incorpore des cations pour équilibrer les charges au sein de son réseau 5 tridimensionnel. La capacité des PB à intégrer cations dans son réseau est exploité en chargeant séparément gadolinium et ions manganèse dans les IP PB pour le contraste IRM.
La justification de la poursuite d'une conception de nanoparticules pour le contraste IRM est à cause deles avantages de cette conception offre par rapport aux agents de contraste d'IRM actuels. La grande majorité des agents de contraste IRM approuvés par la FDA des États-Unis sont chélates de gadolinium paramagnétique qui sont dans la nature et fournissent contraste positif par le mécanisme de relaxation 6,7,8 de spin-réseau. Par rapport à un simple-chelate de gadolinium qui fournit une faible intensité de signal lui-même, l'incorporation de plusieurs ions gadolinium dans le réseau PB des nanoparticules qui assure une meilleure intensité de signal (contraste positif) 3,9. En outre, la présence d'ions de gadolinium multiples dans le réseau de PB augmente la densité de spins global et l'ampleur du paramagnétisme des nanoparticules, ce qui perturbe le champ magnétique local dans son voisinage, générant de ce fait contraste négatif par le mécanisme de relaxation spin-spin. Ainsi, les nanoparticules contenant du gadolinium fonctionnent à la fois comme T 1 (positif) et T deux agents (négative) de contraste 10,11.
Dans un sous-ensemble de patients atteints d'insuffisance rénale, l'administration d'agents de contraste à base de gadolinium a été liée au développement de la fibrose néphrogénique systémique 8,12, 13. Cette observation a conduit des enquêtes sur l'utilisation d'ions paramagnétiques alternatives comme agents de contraste pour IRM. Par conséquent, la conception souple des nanoparticules est adapté pour incorporer des ions manganèse dans le réseau de PB. Similaire à gadolinium-chélates, manganèse-chélates sont également paramagnétique et sont généralement utilisés pour fournir une intensité de signal positif en IRM 7,14. Comme contenant du gadolinium PB IP, les contenant du manganèse PB IP fonctionnent comme T 1 (positif) et T 2 agences (négative) de contraste.
Pour incorporer des capacités d'imagerie de fluorescence, les «noyaux» nanoparticules sont enrobées d'une enveloppe "biofonctionnel" consistant en avidine la glycoprotéine marqué par fluorescence (Figure 1). L'avidine non seulement permet l'imagerie de fluorescence, mais également sert de plate-forme d'accueil pour des ligands biotinylés qui ciblent les cellules et les tissus spécifiques. La liaison avidine-biotine est un des plus forts liens connus, non-covalentes caractérisés par une très forte affinité de liaison entre l'avidine et de la biotine 15. La fixation des ligands biotinylés à l'avidine revêtu PB IP confère des capacités de ciblage moléculaire au SNM PB.
La motivation pour la poursuite de la fluorescence et IRM utilisant PB IP est parce que ces modalités d'imagerie possèdent des caractéristiques complémentaires. imagerie de fluorescence est une des techniques les plus largement utilisés optiques d'imagerie moléculaire, et permet la visualisation simultanée de plusieurs objets à des sensibilités élevées 1,16,17. imagerie de fluorescence est un coffre-fort, la modalité non-invasive, mais est associée à de faibles profondeurs de pénétration et des résolutions spatiales 1,3,16. D'autre part, l'IRM génère une haute temporelled résolution spatiale de manière non invasive et sans la nécessité d'un rayonnement ionisant 1,3,16. Cependant IRM souffre d'une faible sensibilité. Par conséquent imagerie de fluorescence et l'IRM ont été choisis comme les techniques d'imagerie moléculaire en raison de leurs caractéristiques complémentaires de pénétration en profondeur, la sensibilité et la résolution spatiale.
Cet article présente le protocole pour la synthèse et biofonctionnalisation des IP PB, PB IP (PIBb), et contenant du gadolinium-PB IP (MnPB) 10,11 contenant du manganèse. Les méthodes suivantes sont décrites: 1) mesure de la taille, la charge et la stabilité temporelle des nanoparticules, 2) évaluation de la cytotoxicité des nanoparticules, 3) Mesure de la relaxivité IRM, et 4) l'utilisation des nanoparticules pour la fluorescence et l'imagerie par résonance magnétique moléculaire d'une population de cellules cibles in vitro. Ces résultats démontrent le potentiel de PN pour l'utilisation comme agents multimodal, d'imagerie moléculaire in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article a présenté les méthodes pour la synthèse d'une nouvelle classe de multimodales, agents d'imagerie moléculaire à base de nanoparticules bleu de Prusse biofunctionalized. Les modalités d'imagerie moléculaire incorporés dans les nanoparticules sont l'imagerie de fluorescence et l'IRM moléculaire, en raison de leurs caractéristiques complémentaires. Les nanoparticules bleu de Prusse biofunctionalized ont un design noyau-enveloppe. Les principales étapes de la synthèse de ces nan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6 · 3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | — | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | — | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 mL conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1X | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1X) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1X | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 mL round-bottom flask |
References
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