This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.
Мультимодальные, молекулярная визуализация позволяет визуализировать биологические процессы на клеточном, субклеточном и молекулярном уровне резолюций с использованием нескольких взаимодополняющих методов визуализации. Эти визуализации агенты облегчить оценку в режиме реального времени путей и механизмов в естественных условиях, которые усиливают как диагностическую, так и терапевтическую эффективность. Эта статья представляет протокол для синтеза biofunctionalized ферроцинсодержащего наночастиц (Pb NPS) – нового класса веществ для использования в смешанных, приложений молекулярной визуализации. В диагностические методы, заложенные в наночастиц, флуоресценции изображений и магнитно-резонансной томографии (МРТ), имеют дополнительные функции. ПБ НП обладают дизайном ядро-оболочка, где гадолиния и марганца включены в интерстициальных пространствах Б. решетки генерировать контрастные, как в Т 1 и Т 2 -weighted последовательностей. ПБ НП покрыты люминесцентным авидин с помощью электростатического себя-какsembly, что позволяет флуоресцентной томографии. Наночастицы покрытые авидином модифицированы биотинилированных лигандов, которые придают молекулярные возможности ориентации на наночастицах. Стабильность и токсичность наночастиц измеряются, а также их relaxivities МРТ. Мультимодальных, молекулярные возможности визуализации этих biofunctionalized PB НП затем продемонстрировали, используя их для флуоресценции изображений и молекулярной МРТ в пробирке.
Молекулярная визуализация является неинвазивным и направлены визуализации биологических процессов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях 1. Молекулярная визуализация позволяет образец, чтобы оставаться в своем родном микросреды в то время как эндогенные пути и механизмы оцениваются в реальном времени. Как правило, молекулярная визуализация включает введение экзогенного агента для получения изображения в виде небольшой молекулы, макромолекулы, или наночастицы для визуализации, целевой, и проследить соответствующие физиологические процессы изучаемого 2. Различные методы визуализации, которые были изучены в молекулярной визуализации включают МРТ, КТ, ПЭТ, ОФЭКТ, ультразвук, фотоакустика, спектроскопии комбинационного рассеяния света, биолюминесценции, флуоресценции, и прижизненный микроскопии 3. Мультимодальные изображения является сочетание двух или более методов визуализации, где комбинация повышает способность визуализировать и охарактеризовать различные биологические процессы и события 4. Multimodaл изображений использует сильные стороны отдельных методов визуализации, компенсируя при их индивидуальных ограничений 3.
Эта статья представляет протокол для синтеза biofunctionalized ферроцинсодержащего наночастиц (Pb NPS) – нового класса мультимодальных, молекулярных агентов визуализации. ПБ НП используются для флуоресценции изображений и молекулярной МРТ. PB является пигмент, состоящий из чередующихся железа (II) и (III) атомы железа в ГЦК-сети (рисунок 1). PB решетка состоит из линейных цианистых лигандов в Fe II – CN – Fe III связи, которая включает катионы, чтобы сбалансировать расходы в пределах своей трехмерной сети 5. Способность ПБ включить катионы в его решетке эксплуатируется отдельно загрузке гадолиний и ионы марганца в ПБ НП для контрастные.
Основанием для преследуя дизайн наночастиц для контрастные из-заПреимущества Такая конструкция обеспечивает относительно текущих МРТ контрастных агентов. Подавляющее большинство FDA США, утвержденных МРТ контрастных агентов являются хелаты гадолиния, которые парамагнитного в природе и обеспечивают позитивные контраст спин-решеточной механизм релаксации 6,7,8. По сравнению с одной гадолиния-хелата, что обеспечивает низкую интенсивность сигнала по себе, включение нескольких ионов гадолиния в пределах PB решетки наночастиц обеспечивает повышенную интенсивность сигнала (положительный контраст) 3,9. Кроме того, наличие нескольких ионов гадолиния в ПБ решетки увеличивает общую спиновой плотности и величины пара- наночастиц, которая нарушает локальное магнитное поле в его окрестностях, тем самым формируя негативные контраст спин-спинового механизма релаксации. Таким образом, гадолиния, содержащий наночастицы функционировать как Т 1 (положительная) и T 2 (отрицательная) контрастных агентов 10,11.
В подгруппе пациентов с нарушениями функции почек, администрация гадолиния на основе контрастных агентов была связана с развитием нефрогенной системный фиброз 8,12, 13. Это наблюдение побудило расследование использования альтернативных парамагнитных ионов в качестве контрастных агентов для МРТ. Таким образом, универсальная конструкция из наночастиц выполнен с возможностью включать ионы марганца в PB решетки. Подобно гадолиний-хелатов, марганец также хелаты парамагнитных и, как правило, используется для обеспечения интенсивности положительный сигнал в МРТ 7,14. Как и гадолиния, содержащий PB НЧ, содержащее марганец PB НЧ также функционировать как Т 1 (положительной) и T 2 (отрицательный) контрастных агентов.
Для включения возможности визуализации флуоресценции, наночастицы "сердечники" покрыты "биофункциональный" оболочки, состоящей из флуоресцентно-меченый авидин гликопротеина (фиг.1). Авидин не только обеспечивает визуализации флуоресценции, но также служит в качестве установочной платформы для биотинилированных лигандов, которые нацелены на специфические клетки и ткани. Авидин-биотин связь является одним из самых сильных известных, не-ковалентных связей, характеризующихся крайне сильным сродством между авидин и биотин 15. Крепление биотинилированными лигандов авидин-покрытием PB НП наделяет молекулярные возможности направления к ПБ НП.
Мотивация за проведение флуоресценции и МРТ с использованием PB NPS потому, что эти диагностические методы обладают дополнительных возможностей. Флуоресцентной томографии является одним из наиболее широко используемых оптических методов молекулярной визуализации, и позволяет одновременно визуализации нескольких объектов с высокой чувствительностью 1,16,17. Флуоресцентной томографии является безопасным, неинвазивным модальность, но связано с малой глубине проникновения и пространственным разрешением 1,3,16. С другой стороны, МРТ генерирует высокое временное ANд пространственное разрешение неинвазивно и без необходимости ионизирующего излучения 1,3,16. Однако МРТ страдает от низкой чувствительности. Поэтому флуоресценции изображений и МРТ были выбраны в качестве методов молекулярной визуализации из-за их дополнительных особенностей проникновения глубины, чувствительности и пространственным разрешением.
Эта статья представляет протокол для синтеза и biofunctionalization ПБ НП, гадолиний-содержащие ДСП NPS (GdPB), и содержащий марганец PB NPS (MnPB) 10,11. Следующие способы описаны: 1) измерение размера, заряда, и временной стабильности наночастиц, 2) оценка цитотоксичности наночастиц, 3) Измерение МРТ relaxivities и 4) использование наночастиц для визуализации флуоресценции и молекулярной MR популяции целевых клеток в пробирке. Эти результаты демонстрируют потенциал наночастиц для использования в качестве мультимодальных, молекулярных агентов визуализации в естественных условиях.
Эта статья представила методы синтеза нового класса мультимодальных, молекулярных агентов визуализации на основе biofunctionalized ферроцинсодержащего наночастиц. Молекулярные методы визуализации, включенные в наночастицы флуоресценции изображений и молекулярная МРТ, из-за их дополнитель…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6 · 3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
BSG D10 Cell Line | Lab stock | — | |
OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | — | |
Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
Sonicator | QSonica | Q125 | |
Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
1.7 mL conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
15 mL conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
Tube holders | VWR | 82024-342 | |
Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
Trypsin EDTA 0.25% solution 1X | JR Scientific | 82702 | |
Cell Culture Grade PBS (1X) | Life Technologies | 10010023 | |
XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
Pen-Strep 1X | Life Technologies | 15070063 | |
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
100 mL round-bottom flask |