Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal
Summary
This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.
Abstract
Multimodal, הדמיה מולקולרית מאפשרת ההדמיה של תהליכים ביולוגיים ברזולוציות סלולריות, subcellular, ורמה-המולקולרית תוך שימוש בטכניקות הדמיה מרובות, משלימים. סוכני הדמיה אלה להקל על ההערכה של מסלולים ומנגנוני in vivo, אשר משפרים את יעילות שני האבחון וטיפול בזמן אמת. מאמר זה מציג את הפרוטוקול לסינתזה של חלקיקים כחולים פרוסים biofunctionalized (NPS PB) – כיתת רומן של סוכנים לשימוש ביישומי ההדמיה multimodal, מולקולריים. יש שיטות ההדמיה התאגדו בחלקיקים, ההדמיה הקרינה והדמיה בתהודה מגנטית (MRI), תכונות משלימות. הצירופים וPB יש עיצוב ליבה-פגז שבי גדוליניום ויונים מנגן שולבו בתוך חללי ביניים של סריג PB ליצור ניגוד MRI, שניהם בT 1 ו- T 2-משוקלל רצפים. הצירופים וPB מצופים בavidin ניאון באמצעות אלקטרוסטטי עצמית כsembly, המאפשר הדמיה הקרינה. חלקיקים מצופים avidin משתנים עם ligands biotinylated שמקנה יכולות מיקוד מולקולריות לחלקיקים. היציבות והרעילות של חלקיקים נמדדות, כמו גם relaxivities MRI שלהם. יכולות multimodal, מולקולרי ההדמיה של הצירופים וPB biofunctionalized אלה לאחר מכן הפגינו באמצעות אותם לקרינת הדמיה ו- MRI המולקולרי במבחנה.
Introduction
הדמיה מולקולרית היא ההדמיה לא פולשנית וממוקדת של תהליכים ביולוגיים בסלולרי, subcellular, ורמות מולקולריות 1. הדמיה מולקולרית מאפשרת דגימה להישאר במייקרו-הסביבה המקורית שלו בזמן שמסלולי אנדוגני ומנגנונים מוערכים בזמן אמת. בדרך כלל, הדמיה מולקולרית כרוכה ממשל סוכן הדמיה אקסוגניים בצורה של מולקולה, מקרומולקולה, או ננו-חלקיקים קטנים כדי להמחיש, יעד, ואת עקבות תהליכים פיסיולוגיים רלוונטיים של נחקרים 2. שיטות ההדמיה השונות שנחקרו בהדמיה מולקולרית כוללות MRI, CT, PET, SPECT, אולטרסאונד, photoacoustics, ספקטרוסקופיית ראמאן, פליטת אור, הקרינה, ומיקרוסקופיה intravital 3. ההדמיה Multimodal היא השילוב של שתיים או יותר שיטות הדמיה שבו השילוב משפר את היכולת לדמיין ולאפיין תהליכים ביולוגיים ואירועים שונים 4. Multimodaההדמיה l מנצלת את נקודות החוזק של טכניקות הדמיה פרט, תוך מתן פיצוי בגין המגבלות האישיות שלהם 3.
מאמר זה מציג את הפרוטוקול לסינתזה של חלקיקים כחולים פרוסים biofunctionalized (NPS PB) – כיתת רומן של סוכני הדמיה multimodal, מולקולריים. הצירופים וPB משמשים להדמית הקרינה וMRI המולקולרי. PB הוא פיגמנט הכולל לסירוגין ברזל (II) וברזל (III) אטומים ברשת מעוקב במרכז הפנים (איור 1). סריג PB מורכב מligands ציאניד ליניארי בFe II – CN – הצמדת Fe III המשלבת קטיונים לאזן חיובים בתוך הרשת תלת-ממדית שלה 5. היכולת של PB לשלב קטיונים לתוך הסריג שלו מנוצלת על ידי בנפרד טעינת גדוליניום ויונים מנגן לצירופים וPB לניגוד MRI.
הרציונל לרודף עיצוב ננו-חלקיקים לניגוד MRI בגלליתרונות עיצוב זה מציע ביחס לסוכנים בניגוד MRI הנוכחיים. רובם המכריע של סוכנים בניגוד MRI אישרו ה- FDA האמריקאי הם chelates גדוליניום שפאראמגנטיים בטבע ומספק ניגוד חיובי על ידי 6,7,8 מנגנון ההרפיה הספין-סריג. בהשוואה לגדוליניום-chelate יחיד המספק עוצמת אות נמוכה בכוחות עצמו, השילוב של גדוליניום יונים מרובים בסריג PB של חלקיקים מספק משופר עוצמת אות (בניגוד חיובי) 3,9. יתר על כן, הנוכחות של יוני גדוליניום מרובים בתוך סריג PB מגדילה את צפיפות הספין הכוללת וסדר הגודל של פרא-מגנטיויות של חלקיקים, אשר מפריע לשדה המגנטי המקומי בסביבתו, ובכך לייצר ניגוד שלילי על ידי מנגנון ההרפיה ספין-ספין. כך חלקיקים המכיל גדוליניום לתפקד גם כT 1 (חיובי) ו- T 2 סוכנים בניגוד (שלילי) 10,11.
בתת-קבוצה של חולים עם הפרעות בתפקוד הכליתי, הממשל של סוכנים בניגוד מבוסס גדוליניום נקשר להתפתחות של סיסטיק nephrogenic המערכתי 8,12, 13. תצפית זו גרמה חקירות השימוש ביוני פאראמגנטיים חלופיים כסוכנים בניגוד ל MRI. לכן, עיצוב הרב-תכליתי של חלקיקים מותאם לשלב יונים מנגן בתוך סריג PB. בדומה לגדוליניום-chelates, מנגן-chelates גם פאראמגנטיים ומשמשים בדרך כלל כדי לספק עוצמת אות חיובית בMRI 7,14. כמו בצירופים וPB המכיל גדוליניום, הצירופים וPB המכיל מנגן גם לתפקד כT 1 (חיובי) ו- T 2 סוכנים בניגוד (שלילי).
לשלב יכולות הדמיה הקרינה, "הליבות" ננו-החלקיקים מצופות בקליפה "biofunctional" בהיקף של avidin גליקופרוטאין fluorescently שכותרתו (איור 1). Avidin לא רק מאפשר הדמיה הקרינה, אך משמש גם כפלטפורמת עגינה לligands biotinylated כי יעד תאים ורקמות ספציפיים. אג"ח avidin ביוטין הוא אחד מהקשרים החזקים ביותר הידועים, שאינם קוולנטיים המאופיין בזיקה מחייבת חזקה מאוד בין avidin וביוטין 15. הקובץ המצורף של ligands biotinylated למצופי avidin PB הצירופים ומקנה יכולות מיקוד מולקולריות לצירופים וPB.
המוטיבציה לרודף ההדמיה הקרינה וMR באמצעות PB צירופים ובגלל שיטות ההדמיה האלה יש תכונות משלימות. הדמיה הקרינה היא אחת טכניקות ההדמיה הנפוצות ביותר האופטית מולקולריות, ומאפשרת ההדמיה בו זמנית של מספר אובייקטים ברגישויות גבוהות 1,16,17. הדמיה הקרינה היא שיטה בטוחה, לא פולשנית, אך קשורה למעמקים נמוכים של חדירה והחלטות מרחביות 1,3,16. מצד השני, MRI מייצר זמני גבוההרזולוציה מרחבית ד הלא פולשני וללא צורך בקרינה מייננת 1,3,16. עם זאת MRI סובל מרגישות נמוכה. לכן הדמיה הקרינה וMRI נבחרו כטכניקות הדמיה מולקולריות בשל התכונות המשלימות שלהם חדיר לעומק, רגישות, ורזולוציה מרחבית.
מאמר זה מציג את הפרוטוקול לסינתזה וbiofunctionalization של הצירופים וPB, PB צירופים ו( GdPB), ומכיל גדוליניום PB צירופים ו( MnPB) 10,11 המכיל מנגן. השיטות הבאות מתוארות: 1) מדידה של גודל, אחראי, ויציבות זמנית של חלקיקים, 2) הערכה של cytotoxicity של חלקיקים, 3) מדידת relaxivities MRI, ו- 4) שימוש בננו-חלקיקים לקרינה והדמיה מולקולרית MR אוכלוסייה של תאים ממוקדים במבחנה. תוצאות אלו מראות את הפוטנציאל של הצירופים ולשימוש כסוכני multimodal, מולקולרי הדמיה in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה הציג שיטות לסינתזה של כיתת רומן של סוכני multimodal, מולקולריים הדמיה המבוססים על ננו-חלקיקים הכחולים הפרוסים biofunctionalized. שיטות ההדמיה מולקולריות שולבו בחלקיקי הקרינה הדמיה ו- MRI המולקולרי, בשל התכונות המשלימות שלהם. יש לי חלקיקים הכחולים הפרוסים biofunctionalized עיצוב לי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6 · 3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | — | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | — | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 mL conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1X | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1X) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1X | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 mL round-bottom flask |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
- Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
- Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
- . . Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , (2004).
- Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
- Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
- Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do’s and don’t’s. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
- Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
- Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
- Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
- Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
- Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
- Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452 (7187), 580-589 (2008).
- Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
- Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. . Duke Review of MRI Principles. 304, 304 (2012).
- Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
- Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).
