Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Summary

Das Ziel des Protokolls ist es, lymphatische Endothelzellen menschlicher Lymphmissbildung zystenartige Gefäße und Vorhaut mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Anschließende Zellkultur und Expansion dieser Zellen ermöglicht eine neue Stufe der experimentellen Raffinesse für genetische, Proteomik, funktionale und Zelldifferenzierung Studien.

Abstract

Lymphsystems, wie primäre Lymphödem, lymphatischen Missbildungen und lymphatischen Tumoren sind seltene Erkrankungen, die einer erheblichen Morbidität verursachen, aber wenig über ihre Biologie bekannt. Isolierung hochreiner menschlichen lymphatischen Endothelzellen (LECs) von kranken und gesunden Gewebe wäre Studien des lymphatischen Endothels bei genetischen, molekularen und zellulären Ebene zu erleichtern. Es wird erwartet, dass diese Untersuchungen können Ziele für neue Therapien, die die klinische Behandlung von diesen Bedingungen ändern können offenbaren. Ein Protokoll, die Isolierung von humanen Vorhaut LECs und Lymphmissbildung lymphatischen Endothelzellen (LM LECs) beschreibt, wird vorgestellt. Zu erhalten, eine Einzelzellsuspension Gewebe wurde zerkleinert und mit Dispase II und Collagenase II enzymatisch behandelt. Die resultierenden Einzelzellsuspension wurde dann mit Antikörpern gegen Cluster of Differentiation (CD) Marker CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) und podoplanin markiert. StaiNed lebensfähige Zellen wurden auf einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) sortiert werden, um das CD34-CD31 ^{Low Pos} VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos LM LEC Population aus anderen endothelialen und nicht-endothelialen Zellen abzutrennen. Die sortierten LM LECs wurden kultiviert und auf Fibronektin-beschichteten Kolben für weitere experimentelle Nutzung erweitert.

Introduction

Eine Hauptfunktion des lymphatischen Gefäßsystems ist es, Lymphe, einen Überschuß der interstitiellen Flüssigkeit enthaltenden Lipide, Proteine ​​und Zellbestandteile aufnehmen und führen es in die Blutvenensystem. Ein Netzwerk von lymphatischen Kapillaren lenkt Lymphe zu den Lymphknoten, wo sie auf das Vorhandensein von fremden Antigenen, ein wichtiger Prozess bei der Immunüberwachung und Bereitstellung von weißen Blutkörperchen auf fremde Antigene zu neutralisieren gescreent.

Die unidirektionale Lymphsystem beginnt in Geweben mit dem anfänglichen lymphatischen Kapillaren, eine einzigartige Struktur mit einer diskontinuierlichen Einzelschicht von dünnwandigen flachen Endothelzellen mit spezialisierten Zellverbindungen, die Lymphe Eintrag ^1,2 ermöglichen. Diese Kapillaren sind an das Nachbar Bindegewebsmatrix via Verankerung Filamente Gefäß Zusammenbruch in Gegenwart von erhöhten interstitiellen Druck ³ zu verhindern, angebracht. Die anfänglichen Lymphkapillaren münden in Sammel Lymphkapillarendie in größeren Lymphgefäße oder Venen zusammenwachsen. Im Vergleich zu lymphatischen Kapillaren anfänglichen Sammel Lymphgefäße dickere Gefäßwände gepaart lymphatischen Ventile und werden von einem diskontinuierlichen Basalmembran in der wenige glatte Muskelzellen eingebettet ⁴ umhüllt. Koordiniertes Öffnen und Schließen der Ventile und lymphatischen Kontraktion der glatten Muskelzellen erleichtert Lymphfluß ^3. Bei Menschen, die lymphatischen Adern aus verschiedenen Regionen des Körpers verbinden, um Lymphstämme die an zwei Lymphbahnen bilden verschmelzen zu bilden: das Brustgang und das Recht lymphatischen Kanal. Der Ductus Lymphe von der linken Seite des Körpers und von der rechten Seite unterhalb der Brust, während die rechte lymphatischen Kanal Lymphe vom rechten Arm und rechten Seite des Kopfes, des Halses und Thorax. Beide Kanäle leiten Lymphe in die subclavia in den Hals ^5.

Erkrankungen des lymphatischen Systems erworben werden grob in einen gruppiertennd angeboren (Tabelle 1). Beispiele für erworbene Bedingungen Lymphangitis und sekundären Lymphödem. Lymphangitis ist eine Entzündung ein Lymphgefäß aufgrund bakterieller Infektionen. Die betroffenen Lymphgefäße erweitern und füllen mit Exsudat enthält polymorphkernigen Zellen. In der Haut sind diese Lymphgefäße als rote, schmerzhafte subkutane Streifen oft durch Erweiterung der zugehörigen Lymphknoten (Lymphadenitis) ⁶ begleitet sichtbar. Sekundären Lymphödemen entsteht als Folge einer Beschädigung oder Behinderung der Lymphgefäß oder Lymphknoten Obstruktion. Dies führt zu chronischer progressiver Schwellung aufgrund einer Ansammlung von Lymphe distal zur Beschädigung oder Verstopfung. In den entwickelten Ländern wird sekundäre Lymphödem am häufigsten mit malignen Erkrankungen, wo metastasierenden Tumoren behindern Lymphgefäße oder regionalen Lymphknoten oder als Folge der Anti-Krebs-Therapie nach der chirurgischen Entfernung der Lymphknoten, nach der Bestrahlung Fibrose und post-entzündlichen Throm zugeordnetBosis und Narbenbildung ^7. In anderen Teilen der Welt, kann sekundäre Lymphödem sekundär lymphatischen Obstruktion von parasitischen Würmern verursacht werden, wie Wuchereria bancrofti ^6.

Erkrankungen des Lymphgefäßsystems
Erworben	Angeboren
Lymphadenitis Sekundäre Lymphödeme	Primary Lymphödem 10	Sporadische Lymphatische Fehlbildungen 13	Lymphatische Fehlbildungen mit Syndromes 13
	zB Milroy-Syndrom Meige Syndrom	Ganz einfach: Lymphatische Fehlbildungen	zB Klippel-Tranaunay Syndrom Parks Weber-Syndrom Sturge-Weber-Syndrom
		Kombiniert: Kapillar-lymphatischen Missbildungen Kapillar-lymphatischen-venöse Malformation Kapillar-lymphatischen-arteriovenöse Missbildung Kapillar-lymphatischen venösen-arteriovenöse Missbildung

Tabelle 1 Übersicht über die Erkrankungen des lymphatischen Kreislauf-System.

Angeborenen Erkrankungen des lymphatischen Systems umfassen primäre (idiopathische) Lymphödem gedacht, durch genetische Mutationen, Lymphangiektasie und Anomalien des Lymphsystems ^8,9 verursacht werden. Primary Lymphödem kann sporadisch vermutlich durch Neumutationen verursacht, oder geerbt. Lymphsystems kann auch isoliert werden oder einen Teil eines allgemeineren Syndrom ^10. In der pädiatrischen Population, 97% der LympheÖdem ist sporadisch mit Anomalien in lymphatischen Gefäßstruktur, die regionalen Lymphdrainage ¹¹ beeinträchtigen. Milroy Krankheit ist ein Beispiel für primäre Lymphödem durch Mutation in der VEGFR-3-Gen offensichtlich bei der Geburt oder kurz nach ¹² verursacht. Obwohl meist familiäre Zustand der Milroy Krankheit kann auch bei Säuglingen ohne Familiengeschichte von Milroy Krankheit ³² identifiziert werden. Die Schwere einer Lymphödem ist abhängig von der Menge der Lymphe Produktion und die Fähigkeit, Lymphtransport zurück zur venösen Kreislauf ^6.

Basierend auf der klinischen Präsentation und In-situ Endothelzellproliferation sind Anomalien des Lymphsystems lymphatischen Tumoren oder lymphatischen Mißbildungen ¹³ klassifiziert. Kaposiform Lymphangiomatose ist ein Beispiel einer LEC Tumor ^14. Lymphatische Fehlbildungen gedacht werden, um während der Embryonalentwicklung entstehen und wachsen im Verhältnis zum Kind ^15,16. Sie Regress selten, kann aber Leistungsbezogenen asymptomatisch bis zum Trauma oder Infektion fällt schnelles Wachstum, was zu klinischen Komplikationen. Die geordnete Struktur des lymphatischen Netzwerks und Durchführung von Lymphe aus dem Gewebe, um oben beschrieben venösen Blutkreislauf wird in lymphatischen Missbildungen, die von lokalen Sammlungen von abnormalen zystische Strukturen mit Lymphflüssigkeit gefüllt bestehen gestört. Zwar gibt es keine klinischen oder experimentellen Beweis, dass diese zystische Schiffe werden an die Lymphzirkulation verbunden oder dass sie funktions lymphatischen Ventile enthält, wird ihre lymphatischen Identität durch Expression Reihe von lymphatischen Zellmarker wie Podoplanin, CD31, Lymphgefäß Endothelial Receptor 1 bestätigt (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) und VEGFR-3 ^15,17,18. Diese zystische Strukturen kann entweder klein (mikrozystischen) oder groß (macrocystic), aber die meisten lymphatischen Bildungen enthalten sowohl mikrozystischen und macrocystic Komponenten (1) ^16. Nach der Operation injection Sklerotherapie und / oder Radiofrequenz-Ablation des lymphatischen Missbildungen häufig wieder auftreten.

Abbildung 1. Morphologie der menschlichen Lymphgefäße und lymphatischen Missbildungen. Normale menschliche Lymphsystem (A) und Lymphmissbildung Gefäße (B und C) mit einem Antikörper gegen Podoplanin beschriftet (braun-Label, Pfeil). Menschen Lymphmissbildung Gefäße werden durch deutliche Dilatation und erhebliche Unterschiede in der Lumengröße gekennzeichnet. Diese lokalisierten abnormalen zystischen Strukturen können sowohl kleine (mikrozystischen, *) (B) oder groß (macrocystic, #) (C) sein. Die meisten lymphatischen Missbildungen enthalten sowohl mikrozystischen und macrocystic Komponenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen. </ P>

Einige Forscher haben vorgeschlagen, dass lymphatische Fehlbildungen sind eine Entwicklungsstörung des lymphatischen Gefäßsystems, in dem die LECs keinen abnormalen Wachstumspotential, sondern es nicht gelungen, in den normalen Kreislauf ¹⁹ angeschlossen werden. Jedoch haben wir gefunden, dass die LM LECs proliferieren schneller und sind widerstandsfähiger gegen Apoptose als Vorhaut LECs ¹⁵ darauf hindeutet, dass es eine primäre Defekt im LM LECs. Wenn LM LECs sind in einem Maus-Xenograft-Modell implantiert, bilden sie Strukturen erinnern an lymphatischen Missbildungen ^15. Dies unterstützt die Hypothese, dass lymphatischen Bildungen können durch eine oder mehrere somatische Mutationen entstehenden LM LECs während der fetalen Entwicklung verursacht werden. In der Tat haben die jüngsten Berichte eine solche Mutation im p110α katalytische Untereinheit der Phosphoinositid-3-Kinase (PIK3CA) Gen ²⁰ identifiziert.

Angesichts der Fortschritte in der DNA-Sequenzierung Technologie, relevante Mutationen cOuld leichter in isolierten LM LECs identifiziert werden, Führungs zukünftige Studien dieser Bedingungen. Die Isolierung von lebensfähigen LECs würde Vergleiche zwischen abnormalen und normalen LECs in Assays wie Migration, Proliferation, Rohrbildungsfähigkeit und das Überleben in Antwort auf eine reduzierte Nährstoffverfügbarkeit oder proapoptotischen Mittel ¹⁵ zu erleichtern. Isolated LECs würde weiter ermöglichen es uns, zellspezifische Genexpression und Proteomik-Studien durchzuführen, um neue LEC-Subpopulationen abzugrenzen und entdecken Sie neue pharmakologische Wirkstoffe für klinische Behandlung von lymphatischen Missbildungen.

Wir haben bereits eine LEC Isolierung in Anlehnung an magnetische Kügelchen Trennung von LECs von neonatalen Vorhaut und lymphatischen Missbildungen ¹⁵ veröffentlicht. Berichteten wir eine Strategie der Trennung normaler und erkrankter LECs von vaskulären endothelialen Zellen auf der Basis der Abwesenheit von CD34-Expression, gefolgt von Unterwerfen CD34 ^Neg Zellfraktion einer positiven Selektion für CD31.Jedoch wurde dieses Verfahren durch die Anwesenheit von restlichem nicht-endothelialen Zellen behindert. Dies war unabhängig von der Entfernung von Epidermis vor den nachfolgenden Bindegewebe Verdauung. Diese Verunreinigungen in der Regel vermehrt sich schneller und damit schließlich die Endothelzellkulturen trotz nachfolgenden Versuche, LEC Isolierung wiederholen überwuchsen. Tatsächlich wird eine anfängliche Kontamination der Nicht Endothelzellen so niedrig wie 2% bis 5% war ausreichend, um den LEC Bevölkerung ¹⁵ überwältigen. Dies veranlasste uns, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung Verfahren als Option zu LEC Zelle Ausbeute und Reinheit zu verbessern erkunden. Zusätzlich verwendeten wir Multiparameter Sortierung die Spezifität der LEC Populationen erweitern, Zugabe VEGFR-3 und podoplanin den Selektionsmarker CD34 CD31 ^{Low Pos} VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos LECs identifizieren.

Die Gründe für die Auswahl dieser Marker wurde auf die Berichte auf der Grundlage, dass, während LECs und Blut vaskulären endothelialen cells haben viele Zelloberflächenmarker gemeinsam, wie CD31, LECs zeigen phänotypische Veränderung ihrer Expression von CD34, Podoplanin und VEGFR-3 Zelloberflächenmarker im Vergleich zu Blutgefäßendothelzellen ^21-23. CD31 ist ein 130 kDa Transmembranglycoprotein auch als Thrombozyten endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM-1) bekannt. Es wird betrachtet, eine pan-endotheliale Zellmarker, da es auf allen Arten von Blut- und Lymphgefäße ^21,24,25 zum Ausdruck kommt. CD34 ist auf den meisten hämatopoetischen Vorläufer vorliegende 110-kDa Transmembran-Glykoprotein und Stammzellen, vaskuläre Endothelzellen und einige Lymphgefäße ^26.

VEGFR-3, der Rezeptor für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren C und D, ist anfänglich vorhanden auf die Entwicklungs Venen im Maus-Embryo, aber nach lymphatischen Spezifikation durch den Transkriptionsfaktoren reguliert SRY bezogenen HMG-Box (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f Schauspieler 2 (COUPTF-II) und PROX-1, VEGFR-3 ist venösen Ausdruck verloren, und es wird zu embryonalen LECs ^25,27 beschränkt. Podoplanin, ein 38 kDa Membran Mucoprotein, wird zuerst auf Lymphgefäße bei etwa embryonaler Tag 11 (~ E11.0) von Maus-Embryonalentwicklung ²⁸ festgestellt und während es ist stark von mikrovaskulären Lymphgefäße, Podoplanin Expression durch macrocystic Lymphendothel in lymphatischen Missbildungen zum Ausdruck ist variabler ^15. Durchflusszytometrie Experimente legen nahe, dass zumindest einige CD34 CD31 ^{hoch Pos} Endothelzellen exprimieren das lymphatische Marker podoplanin ^29. Obwohl systematische Bewertung LYVE-1 und Podoplanin Färbung in menschlichen lymphatischen Malformationen zeigten, dass beide sind effektiv bei der Färbung Lymphmissbildung Endothel ^30, in normalen Geweben, LYVE-1 wurde berichtet, dass stark in der Anfangs lymphatischen vorhandenKapillarendothel aber reduziert und in der Sammel Lymphendothel ³¹ gar nicht vorhanden. Da unser Ziel ist es, zu isolieren, sowohl die Anfangs- und Sammeln lymphatischen Endothelzellen wir entschieden haben, nicht zu LYVE-1 als Teil unserer Zellenauswahl-Strategie zu verwenden. Schließlich wurde die Entscheidung, diese Marker setzen auch von der Verfügbarkeit von Antikörpern, die diagnostisch für die Markierung von Lymphgefäßen für mikroskopische Bildgebung verwendet werden, eine Funktion, die Korrelation zwischen der Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz-Studien erlauben würde basiert.

Dieser Artikel wird die Gewebeaufschlussverfahren, Zellfärbung und FACS-Einstellungen für eine erfolgreiche Isolierung von CD34 ^Low CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos Podoplanin ^Pos LECs als auch CD34 ^Hohe CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos Podoplanin ^Pos Endothelzellen aus Vorhaut und Lymphmissbildung erforderlich beschreiben Gewebe.

Protocol

Ethics Statement: Ethische Genehmigung für die Sammlung von Lymphmissbildung und Vorhaut Geweben wurde von den Human Research Ethik-Kommissionen in der Royal-Kinderklinik, Melbourne, Australien erhalten. Unterzeichnet Zustimmung wurde von Patienten Eltern erhielten vor der Operation. Gewebeproben wurden von Patienten mit LMs zogen chirurgischen Verfahren als Teil ihrer klinischen Management und elektiven Beschneidung diagnostiziert gesammelt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National …

Representative Results

Nach der anfänglichen Gewebe Verdauung, nach 24 Stunden in Kultur von unfraktionierten Proben deutliche endothelialen Zellkolonien zusammen mit Fibroblasten-ähnliche Zellen und glatten Muskelzellen beobachtet werden (Abbildung 2A). Im Anschluss an das Sortieren und nach 24 Stunden in der Zellkultur, die CD34 Low CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos Zellen befestigen und zeigen typische Kopfsteinpflastermorphologie (2B und C)….

Discussion

LECs spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Fluid, Immunantwort auf fremde Antigene, und die Absorption und den Transport von bestimmten Nährstoffen. LEC-Homöostase durch Krankheitsprozesse wie bakterielle Infektionen und Tumormetastasen betroffen sein, aber LECs können somatische Mutationen, die in der Bildung von dysfunktionalen Lymphgefäße und signifikante Morbidität für die betroffenen Patienten führen zu entwickeln. Um mehr Verständnis Lymphmissbildung Ätiologie durch Implan…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalogue Number	Description
DMEM	Life Technologies (Gibco)	11965-092	Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	CC-3202	EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C	R&D Systems	2179-VC-025	Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F2006	Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent	Life Technologies (Gibco)	A11105-01	StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye	Life Technologies (Gibco)	15250-061	Used as a viability stain.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	Used at 0.04%
Collagenase II	Worthington Lab	4176	Used at 0.25%
DNase I	Roche Applied Biosciences	11284932001	Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers	BD Falcon	352350
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59	BioLegend	356204	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581	BioLegend	343516	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59	BioLegend	303116,	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.	BioLegend	337006	Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400112	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400126	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400120	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758	BioLegend	400525	Used at 1:200 dilution