다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리
Summary
이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 인간의 림프 기형 낭종 같은 선박과 포피 선을 긋고있는 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이후 세포 배양하고이 세포의 확장, 유전 단백체, 기능 및 세포 분화 연구를위한 실험적인 새로운 수준의 정교한을 허용합니다.
Abstract
같은 차 림프 부종, 림프 기형 및 림프 종양과 같은 림프 시스템 장애는 상당한 사망률의 원인이 있지만, 거의가 자신의 생물학에 대해 알려진 드문 경우입니다. 질병과 건강한 조직에서 매우 순수한 인간의 림프 내피 세포 (수정체 상피)을 분리하는 것은, 유전 분자 및 세포 수준에서 림프 내피 세포의 연구를 촉진한다. 이들 연구는 이러한 조건의 임상 관리를 변경할 수 있습니다 새로운 치료법에 대한 목표를 공개 할 수 것으로 예상된다. 수정체 상피 및 림프 기형 림프 내피 세포 (LM 수정체 상피) 포피 인간의 고립을 설명하는 프로토콜이 표시됩니다. 획득하기 위해 단일 세포 현탁액 조직 다진 및 효소 디스 파제 II 및 II 콜라겐을 사용하여 처리 하였다. 얻어진 단일 세포 현탁액을 분화 (CD) 마커 CD34, CD31, 혈관 내피 성장 인자 3 (VEGFR-3) 및 PODOPLANIN의 클러스터에 대한 항체로 표지 하였다. 스테인레스네드 가능한 세포는 다른 내피 세포 및 비 혈관 내피 세포에서 CD34 CD31 낮은 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 LM LEC 인구를 분리하는 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)에 분류되었다. 분류 LM 수정체 상피가 배양 및 추가 실험 사용 피브로넥틴 코팅 된 플라스크에 확대했다.
Introduction
림프계 혈관 시스템의 주요 기능은 림프, 지질, 단백질 및 세포 성분을 함유하는 과량의 간질 유체를 흡수하고, 피 정맥 시스템으로 수행 할 수있다. 임파 모세 혈관의 네트워크가 외부 항원, 면역 감시 및 외래 항원을 중화 백혈구의 전개에 중요한 프로세스의 존재에 대해 스크리닝 림프절 림프 지시한다.
단방향 림프계 초기 림프 모세관, 림프 엔트리 1,2- 허용 특화된 세포 접합부와 박벽 평면 내피 세포의 단일 층을 가진 불연속 독특한 구조와 조직에서 시작한다. 이러한 증가 된 모세관 압력 간극 (3)의 존재 하에서 혈관 붕괴를 방지하기 위해 필라멘트를 고정 통하여 인접 결합 조직 매트릭스에 부착된다. 림프 모세관 수집에 빈 초기 림프 모세 혈관그 큰 림프관이나 혈관에 합체. 비교 림프관 두껍게 혈관벽, 페어링 림프 밸브가 몇 평활근 세포 (4)를 포함하는 불연속 기저막에 의해 이탈되어 수집 임파 모세 혈관 최초. 평활근 세포의 협정 개구 및 림프 밸브 폐쇄 및 수축은 림프 (3)의 흐름을 용이하게한다. 흉관과 오른쪽 림프관 : 인간에서, 신체의 여러 지역에서 림프계 혈관 두 림프 덕트를 형성하기 위해 병합 림프계 줄기를 형성하는 조인. 흉관 가슴 아래 신체의 좌측에서 우측에서 림프 배수 동안 머리, 목 및 가슴의 오른팔과 오른쪽에서 오른쪽 림프관 배수 림프절. 두 덕트 목 5 쇄골 하 정맥에 림프를 실시하고 있습니다.
림프 시스템의 장애는 크게 취득으로 그룹화ND 선천성 (표 1). 취득 조건의 예는 림프관과 이차 림프 부종이다. 림프관 염 인해 세균 감염에 림프관의 염증이다. 영향을받는 림프관은 팽창과 삼출물 포함 다형 핵 세포를 입력합니다. 피부, 이러한 림프관은 종종 관련된 배수 림프절 (임파선 염) 6의 확대와 함께 빨강, 고통스러운 피하 줄무늬로 볼 수 있습니다. 차 림프 부종은 림프관 또는 림프절 방해 손상 또는 방해의 결과로 발생한다. 이는 손상이나 장애물에 림프 말단의 축적으로 만성 진보적 인 팽창에 연결됩니다. 선진국에서는 이차 림프 부종은 가장 일반적으로 전이되는 종양 림프관 또는 림프절을 방해하거나, 항암 요법의 결과로서 림프절, 조사 후 섬유증 및 염증 후 throm 제거 수술 따라 악성 종양과 연관된bosis 및 흉터 7. 세계의 다른 부분에서, 이차 림프 부종은 사상충 6으로 기생충에 의한 림프 방해에 보조 할 수있다.
| 림프 혈관 시스템의 장애 | |||
| 획득 한 | 타고난 | ||
| 림프절염 이차 림프 부종 | 차 림프 부종 (10) | 산발적 림프 기형 (13) | 증후군 (13)와 림프 기형 관련 |
| 예를 들어, Milroy는 증후군 Meige 증후군 | 간단한 : 림프 기형 | 예를 들어, Klippel-Tranaunay 증후군 공원 웨버 증후군 스터 지 – 웨버 증후군 | |
| 결합 : 모세관 – 림프 기형 모세관 – 림프 – 정맥 기형 모세관 – 림프 – 동정맥 기형 모세관 – 림프 정맥 – 동정맥 기형 | |||
림프 혈관 시스템의 장애 표 1. 개요.
림프계의 선천성 장애는 유전 적 돌연변이, 림프관 확장증과 림프 시스템 8,9의 이상에 의해 발생하는 것으로 생각 차 (특발성) 림프 부종을 포함한다. 차 림프 부종은 아마 드 노보 돌연변이에 의해 발생, 또는 상속 산발적 될 수 있습니다. 림프 질환은 또한 단리 될 또는 더 일반화 증후군 (10)의 일부를 포함 할 수있다. 림프의 소아에서, 97 %림프 부종은 지역적 배수 (11)을 손상 림프관 구조 이상으로 산발적이다. Milroy는 질환은 출생시 분명 또는 직후 12 VEGFR-3 유전자의 돌연변이에 의해 발생 차 림프 부종의 예입니다. 대부분 가족 상태이지만, Milroy는 질환도 Milroy는 질병 (32)의 가족 병력이없는 영아에서 확인 할 수있다. 어떤 림프 부종의 정도는 림프 생산 및 정맥 순환 6 림프를 다시 수송 능력의 양에 따라 달라집니다.
임상 양상과 현장 내피 세포 증식에 본사를 둔, 림프계의 이상은 림프 종양 또는 림프 기형 (13)으로 분류된다. Kaposiform lymphangiomatosis는 LEC 암 (14)의 예이다. 림프 기형은 배아 개발하는 동안 발생 및 아동 (15, 16)에 비례하여 증가 할 것으로 생각된다. 그들은 거의 퇴화 없지만 remai 수 있습니다N 증상이 외상이나 감염은 임상 적 합병증에 이르는 빠른 성장을 침전 될 때까지. 상기 한 정맥 순환에 조직에서 림프 네트워크 및 림프의 전도의 질서 구조는 림프 유체로 채워진 이상 낭성 구조의 지역화 된 컬렉션을 구성 림프 기형에 교란된다. 이러한 낭포 성 혈관들이 기능 림프 밸브를 포함하는 림프 순환에 연결 또는 것을 임상 적 또는 실험적 증거는 없지만, 자신의 림프 ID는 같은 PODOPLANIN, CD31, 림프 혈관 내피 세포의 수용체 1과 림프 세포 마커의 범위의 발현에 의해 확인 (LYVE-1), 프로스페로의 호 메오 박스 단백질 1 (PROX-1) 및 VEGFR-3 15,17,18. 이 낭성 구조는 하나의 작은 (microcystic) 또는 대형 (macrocystic)을 할 수 있지만, 대부분의 림프 기형은 microcystic과 macrocystic 구성 요소 (그림 1) (16)을 모두 포함한다. 수술 후, injectioN 경화 요법 및 / 또는 무선 주파수는 림프 기형은 종종 다시 발생 절제.
인간의 림프 혈관과 림프 기형의 그림 1. 형태론. 보통 사람의 림프 (A)와 PODOPLANIN에 항체로 표지 림프 기형 혈관 (B와 C) (갈색 라벨, 화살표). 인간의 림프 기형 혈관이 현저하게 팽창과 루멘의 크기에 상당한 변화를 특징으로한다. 이러한 지역화 이상 낭성 구조는 작은 (microcystic, *) (B) 또는 대형 (macrocystic, #) (C)이 될 수 있습니다. 대부분의 림프 기형 모두 microcystic과 macrocystic 구성 요소가 포함되어 있습니다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </ P>
일부 연구자들은 림프 기형은 수정체 상피의 이상 성장 가능성이없는 대신 정상적인 순환 (19)에 연결하는 데 실패하는 림프 혈관의 발달 장애를 나타내는 것을 제안했다. 그러나, 우리는 LM 수정체 상피 빠른 증식과 수정체 상피 (15)가 LM 수정체 상피에서 일차 결함이 있음을 시사 포피 아폽토시스보다 더 내성임을 발견 하였다. LM 수정체가 마우스 이종 이식 모델에서 이식되는 경우, 그들은 림프 기형 15 연상 구조를 형성한다. 이것은 림프 기형은 태아의 개발 과정에서 LM 수정체 상피에서 발생 하나 이상의 체세포 돌연변이에 의해 발생 될 수 있음을 가설을 지원합니다. 사실, 최근의 보고서는 포스-3 키나제 (PIK3CA) 유전자 (20)의 p110α 촉매 서브 유닛에 하나의 돌연변이를 확인했다.
DNA 염기 서열 기술, 관련 돌연변이의 C의 발전을 감안할 때울드는 더 쉽게 이러한 조건의 미래 연구를 안내, 고립 된 LM 수정체 상피에서 확인 될 수있다. 가능한 수정체 상피의 분리가 감소 영양소 가용성 또는 프로 – 세포 사멸 에이전트 (15)에 대한 응답 등의 이동, 증식, 튜브 형성 능력과 생존 등의 분석에서 비정상과 정상 수정체 상피 사이의 비교를 용이하게한다. 고립 된 수정체 상피 더 새로운 LEC의 소집단을 묘사하기 위해, 세포 특이 유전자 발현 및 단백질 체학 연구를 수행 할 수있게하고 림프 기형의 임상 관리에 적합한 새로운 약리 에이전트를 발견 할 것입니다.
우리는 이전에 신생아 포피과 림프 기형 15 수정체 상피의 자기 비드 분리에 따라 LEC 분리 방법을 발표했다. 우리는 CD31 양성 선택에 NEG CD34 세포 분획을 실시 하였다 CD34 발현의 유무에 기초하여 혈관 내피 세포에서 정상 및 질병 수정체 상피를 분리 전략을보고했다.그러나,이 방법은 잔류 비 – 내피 세포의 존재에 의해 방해 하였다. 이는 후속 결합 조직 분해 이전 표피를 제거 독립적이었다. 이러한 오염 물질은 일반적으로 더 빠르게 증식하므로 결국 LEC 분리를 반복하는 후속 시도에도 불구하고 내피 세포 배양을 overgrew. 실제로, 2 ~ 5 %의 낮은 비 – 내피 세포의 초기 오염 LEC 인구 (15)을 압도하기에 충분했다. 이 LEC 세포 수율과 순도를 향상시킬 수있는 옵션으로 형광 활성 세포 정렬 방법을 탐구하는 우리를 자극했다. 또, CD34 CD31 순위 낮음 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 수정체 상피를 식별하는 선택 마커 및 VEGFR-3을 첨가 PODOPLANIN, LEC 개체군의 특이성을 향상시키기 위해 분류 다중 파라미터를 사용했다.
이러한 마커를 선택하기위한 이론적 근거는 보고서를 기반으로 한 것 수정체 상피 및 혈액 혈관 내피 가전 동안혈액 혈관 내피 세포에 비해 21-23 LLS 예컨대 CD31 같은 공통의 많은 세포 표면 마커를 가지고, 수정체는 CD34, PODOPLANIN 및 VEGFR-3 세포 표면 마커의 발현에서 표현형 변화를 나타낸다. CD31는 또한 혈소판 내피 세포 부착 분자 1 (PECAM-1)로 알려진 130 kDa의 막 횡단 당 단백질이다. 그것은이 혈액과 림프 혈관 21,24,25 모든 유형에서 발현되기 때문에 범 내피 세포 마커로 간주됩니다. CD34는 대부분의 조혈 전구에 110-kDa의 횡단 당 단백질 존재하고 세포, 혈관 내피 세포와 일부 림프관 26 줄기.
VEGFR-3, 혈관 내피 성장 수용체, C 및 D 요인 마우스 배아 현상 정맥에 초기에 존재하지만 전사에 의해 규제 림프 명세서에 이어 (SOX) -18, C의 hicken을 SRY 관련 HMG-상자 요인 O valbumin U pstreaM p를 romoter T는 ranscription f를 배우 2 (COUPTF-II) 및 PROX-1, VEGFR-3 정맥 표현이 손실되고 이는 배아 수정체 상피 25, 27로 제한된다. PODOPLANIN는 38 kDa의 막을 mucoprotein, 최초의 마우스 배아 발달 (28)의 약 배아 림프관 일 (11) (~ E11.0)에 주목하고 강력하게 미세 혈관 림프 혈관, 림프 기형에 macrocystic 림프 내피 세포에 의해 PODOPLANIN 식으로 표현된다 동안 15 개 변수입니다. 실험은 적어도 일부 CD34 CD31 높은 순위 내피 세포는 림프 마커 PODOPLANIN (29)을 표현하는 것이 좋습니다 유동 세포 계측법. 인간의 림프 기형에 LYVE-1과 PODOPLANIN 염색의 체계적인 평가는 모두 LYVE-1 초기 림프에 강하게 존재하는 것으로보고, 정상 조직에서, 림프 기형의 내피 (30) 염색에 효과가 있음을 보여 주었다 있지만모세 혈관 내피 세포하지만 감소 수집 림프 내피 (31)도 존재. 우리의 목표는 분리이므로 모두 우리가 선택했다 초기 및 수집 림프 내피 세포는 우리의 셀 선택 전략의 일환으로 LYVE-1을 사용하지. 마지막으로, 이러한 마커를 사용하는 결정은 현미경 이미징 림프 혈관을 라벨에 대한 단적으로 사용되는 항체의 가용성, 유동 세포 계측법 및 면역 연구 사이의 상관 관계를 허용 할 기능을 기반으로했다.
이 문서는 포피와 림프 기형에서 CD34 낮은 CD31 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 수정체 상피의 성공적인 분리뿐만 아니라 CD34 높은 CD31 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 내피 세포에 필요한 조직 소화 방법, 세포 염색 및 FACS 설정을 설명합니다 조직.
Protocol
Representative Results
Discussion
수정체 상피 유체 항상성, 외래 항원 흡수 및 일부 영양소의 수송에 대한 면역 반응을 유지하는데 중요한 역할을한다. LEC 항상성은 박테리아 감염 및 종양 전이와 같은 질병 과정에 의해 영향을받을 수 있지만, 수정체 상피 또한 영향을받는 환자에 대한 역기능 림프관 형성 및 이환율을 초래할 체세포 돌연변이를 개발할 수있다. 생체 이식 및 생체 외 실험을 통해 림프 기형 병인 더 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 베이커 재단과 Zerina Lokmic의 지원 로얄 어린이 재단 '과학 원정대의 여성을 인정하고 싶습니다. 앤드류 G. Elefanty와 에두아르 G. 스탠리는 NHMRC 선임 연구 펠로우 있습니다. 자신의 실험실에서 작업은 NHMRC 및 줄기 세포 호주에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Description |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 | |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
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