Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

Summary

O objetivo deste protocolo é para isolar as células endoteliais que revestem os vasos linfáticos humanos quisto-como malformação linfática e foreskins usando células activadas por fluorescência (FACS). Cultura de células subsequente e expansão destas células permite um novo nível de sofisticação experimental para estudos genéticos, proteomic, funcionais e diferenciação celular.

Abstract

Do sistema linfático, como linfedema primário, malformações linfáticas e tumores linfáticos são condições raras que causam morbidade significativa, mas pouco se sabe sobre a sua biologia. Isolamento de células altamente puros humanas endoteliais linfáticas (LECs) a partir de tecido doente e saudável iria facilitar estudos sobre o endotélio linfático em níveis genéticos, moleculares e celulares. Prevê-se que estas investigações podem revelar alvos para novas terapias que podem mudar o manejo clínico dessas condições. Um protocolo descrevendo o isolamento de prepúcio humano LECs e células endoteliais linfáticas malformação linfática LM (LECs) é apresentada. Para obter uma única suspensão de células do tecido foi triturada e tratada enzimaticamente usando colagenase e dispase II II. A suspensão de célula única resultante foi, em seguida, marcadas com anticorpos para o aglomerado de diferenciação (CD) marcadores CD34, CD31, Factor de Crescimento Endotelial Vascular-3 (VEGFR-3) e podoplanin. Staicélulas viáveis ​​nidas foram classificados em um separador de células activado por fluorescência (FACS) para separar o CD34 CD31 ^{Baixa Pos} VEGFR-3 população ^{Pos Pos} podoplanin LM LEC de outro endoteliais e células não endoteliais. Os LM LECs ordenados foram cultivadas e expandidas em frascos revestidos com fibronectina para uso mais experimental.

Introduction

Uma das principais funções do sistema vascular linfático é absorver linfa, um excesso de fluido intersticial que contém lipídeos, proteínas e componentes celulares, e conduzi-la para o sistema venoso do sangue. Uma rede de capilares linfáticos dirige linfa para os nódulos linfáticos onde é rastreada quanto à presença de antigenes estranhos, um processo importante na vigilância e implantação de células brancas do sangue para neutralizar os antigénios estranhos imune.

O sistema linfático unidireccional começa em tecidos com o capilar linfático inicial, uma estrutura única, com uma única camada descontínua de células endoteliais planas de parede fina com junções de células especializadas que permitem a entrada de linfa ^1,2. Estes capilares estão ligados à matriz do tecido conjuntivo vizinho através filamentos de ancoragem para prevenir o colapso navio em presença de um aumento da pressão intersticial ^3. Os capilares linfáticos iniciais vazios para recolha de capilares linfáticosque se aglutinam em vasos linfáticos maiores ou veias. Em comparação com o inicial vasos capilares linfáticos, recolha de vasos linfáticos têm paredes mais espessas, válvulas dos vasos linfáticos e emparelhados são revestidos por uma membrana basal descontínua em que algumas células de músculo liso são incorporados ^4. Coordenada abertura e fecho de válvulas linfáticos e contracção de células musculares lisas facilita o fluxo de linfa ^3. Nos seres humanos, os vasos linfáticos de várias regiões do corpo se juntam para formar troncos linfáticos que se fundem para formar dois canais linfáticos: o ducto torácico e ducto linfático direito. O ducto torácico drena a linfa do lado esquerdo do corpo e do lado direito abaixo do peito, enquanto o duto linfático drena a linfa desde o braço direito e no lado direito da cabeça, pescoço e tórax. Ambas as condutas conduzir linfa nas veias subclávia no pescoço ^5.

Desordens do sistema linfático são agrupadas em uma adquiridaND congénita (Tabela 1). Exemplos de condições adquiridas são linfangite e linfedema secundário. Linfangite é uma inflamação de um vaso linfático devido a uma infecção bacteriana. Os vasos linfáticos afetados dilatar e encher com exsudado contendo células polimorfonucleares. Na pele, estes vasos linfáticos são visíveis como faixas vermelha subcutânea, dolorosa muitas vezes acompanhada por alargamento do nó de linfa de drenagem associada (linfadenite) ^6. Linfedema secundário surge como consequência de danos ou obstrução do vaso ou linfonodo obstrução linfática. Isto leva ao inchaço crônica progressiva devido ao acúmulo de linfa distal ao dano ou obstrução. Nos países desenvolvidos, linfedema secundário é mais comumente associado com a malignidade onde tumores metastasizing obstruir vasos linfáticos ou linfonodos regionais, ou como consequência da terapia anti-câncer após a remoção cirúrgica dos gânglios linfáticos, fibrose pós-irradiação e Throm pós-inflamatóriaBosis e cicatrizes ^7. Em outras partes do mundo, linfedema secundário pode ser secundária à obstrução linfática causada por vermes parasitas, tais como Wuchereria bancrofti ^6.

Distúrbios do sistema vascular linfático
Adquirido	Congênito
Linfadenite Linfedema secundário	Linfedema Primário 10	Esporádicos linfáticos Malformações 13	Linfático malformações associadas a síndromes 13
	por exemplo, Síndrome de Milroy Síndrome de Meige	Simples: As malformações linfáticas	por exemplo, Síndrome de Klippel-Tranaunay Weber Parques Síndrome de Sturge-Weber
		Combinado: Malformações capilares linfático- Malformação capilar-linfático-venosa Malformação capilar-linfático-artério Capilar-linfático malformação arteriovenosa venosa-

Tabela 1. Visão geral das desordens do sistema vascular linfático.

Doenças congênitas do sistema linfático incluem primária (idiopática) linfedema pensado para ser causado por mutações genéticas, lymphangiectasia e anomalias do sistema linfático ^8,9. Linfedema primário pode ser esporádica, presumivelmente causada por mutações de novo, ou herdado. Desordens linfáticas também pode ser isolado ou compreendem parte de uma síndrome mais generalizada ^10. Na população pediátrica, 97% da linfaedema é esporádica com anormalidades na estrutura de vasos linfáticos que prejudicam a drenagem linfática regional de ^11. Doença de Milroy é um exemplo de linfedema primário causada por uma mutação no gene do VEGFR-3 no momento do nascimento ou evidentes logo após ^12. Embora na maior parte condição familiar, doença de Milroy, também podem ser identificados em lactentes sem história familiar de doença de Milroy ^32. A gravidade de qualquer linfedema é dependente da quantidade de produção de linfa e capacidade de transporte da linfa de volta para a circulação venosa ^6.

Com base na apresentação clínica e na proliferação de células endoteliais situ, anomalias do sistema linfático são classificados como tumores linfáticos ou malformações linfáticas ^13. Kaposiforme linfoangiomatose é um exemplo de um tumor LEC ^14. As malformações linfáticas são pensados ​​para surgem durante o desenvolvimento embrionário e crescer em proporção à criança ^15,16. Eles raramente regridem, mas pode remain assintomática até trauma ou infecção precipita crescimento rápido levando a complicações clínicas. A estrutura ordenada da rede linfática e condução da linfa do tecido a circulação venosa descrito acima é perturbado em malformações linfáticas que consistem em coleções localizadas de estruturas císticas anormais cheias de líquido linfático. Embora não haja evidência clínica ou experimental que estes vasos císticas são ligados à circulação linfática ou que eles contêm válvulas linfáticos funcionais, a sua identidade linfático é confirmada por expressão de gama de marcadores de células linfáticas, como podoplanin, CD31, linfática Veículo Endotelial Receptor 1 (LYVE-1), proteína homeobox Prospero 1 (PROX-1) e VEGFR-3 ^15,17,18. Estas estruturas císticos pode ser pequena (microcístico) ou grande (macrocísticos), mas a maioria das malformações linfáticas conter tanto microcístico e macrocísticas componentes (Figura 1) ^16. Após a cirurgia, injection escleroterapia e / ou ablação por radiofreqüência as malformações linfáticas muitas vezes reaparecer.

Figura 1. Morfologia dos vasos linfáticos humanos e malformações linfáticas. Linfático humano normal (A) e vasos linfáticos malformação (B e C) marcados com o anticorpo para podoplanin (etiqueta castanho, seta). Vasos linfáticos humanos malformação são caracterizadas por acentuada dilatação e uma considerável variação no tamanho do lúmen. Estas estruturas anormais císticas localizadas pode ser pequena (microcístico, *) (B) ou grande (macrocísticos, #) (C). A maioria das malformações linfáticas conter ambos os componentes microcísticas e macrocísticas. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura. </ P>

Alguns pesquisadores sugeriram que as malformações linfáticas representam um transtorno do desenvolvimento da vasculatura linfática em que os LECs não tem potencial de crescimento anormal, mas em vez disso não conseguiram se conectar à circulação normal ^19. No entanto, verificou-se que os LECs LM proliferar mais rapidamente e são mais resistentes à apoptose de prepúcio LECs ¹⁵ sugerindo que existe um defeito primário na LM LECs. Quando LM LECs são implantadas em um rato modelo de xenotransplante, eles formam estruturas que lembram malformações linfáticas ^15. Isto suporta a hipótese de que as malformações linfáticas pode ser causada por uma ou mais mutações somáticas que surgem no LM LECs durante o desenvolvimento fetal. De facto, relatórios recentes identificaram uma tal mutação na subunidade catalítica de p110α (PIK3CA) gene ^20-Quinase Phosphoinositide-3.

Tendo em conta os avanços na tecnologia de sequenciamento de DNA, mutações relevantes cOuld ser mais facilmente identificadas em isolados LM LECs, orientando futuros estudos sobre essas condições. O isolamento de LECs viáveis ​​seria facilitar as comparações entre LECs anormais e normais em ensaios, tais como a migração, proliferação, capacidade tubo de formação e sobrevivência em resposta à reduzida disponibilidade de nutrientes ou agentes pró-apoptóticos ^15. Isolado LECs iria mais permitir-nos de realizar a expressão de genes específicos de células e estudos de proteômica, para delinear novas subpopulações LEC e descobrir novos agentes farmacológicos adequados para o manejo clínico de malformações linfáticas.

Nós já publicou um método de isolamento LEC com base na separação magnética talão de LECs de prepúcio neonatal e malformações linfáticas ^15. Nós relatou uma estratégia de separar LECs normais e doentes a partir de células endoteliais vasculares com base na ausência de expressão CD34, seguida por sujeição fração de células CD34 ^Neg a selecção positiva para CD31.No entanto, este método foi prejudicado pela presença de células não endoteliais residuais. Isto foi independente da epiderme remoção antes da digestão posterior do tecido conjuntivo. Estes contaminantes geralmente proliferam mais rapidamente e, assim, eventualmente overgrew as culturas de células endoteliais, apesar das tentativas posteriores de repetir LEC isolamento. Com efeito, uma inicial de contaminação de células não endoteliais tão baixas como 2% a 5% era suficiente para submergir a população LEC ^15. Isto levou-nos a explorar método separação de células activadas por fluorescência como uma opção para melhorar o rendimento das células LEC e pureza. Além disso, utilizou-se vários parâmetros de classificação para aumentar a especificidade das populações LEC, a adição de VEGFR-3 e podoplanin para os marcadores de selecção para identificar CD34 CD31 ^{de baixo Pos} VEGFR-3 ^{Pos Pos} podoplanin LECs.

A justificativa para selecionar esses marcadores baseou-se nos relatórios que enquanto ce LECs e vascular endotelial sangueLLS tem muitos marcadores da superfície celular em comum, tais como CD31, LECs mostrar variação fenotípica em sua expressão de CD34, podoplanin e VEGFR-3 marcador da superfície celular quando comparado ao sangue células endoteliais vasculares ^21-23. CD31 é uma glicoproteína transmembranar de 130 kDa, também conhecido como molécula de adesão de plaquetas de células endoteliais 1 (PECAM-1). Ele é considerado como um marcador celular pan-endotelial, uma vez que é expresso em todos os tipos de vasos sanguíneos e linfáticos ^21,24,25. CD34 é 110 kDa transmembranar da glicoproteína presente em células progenitoras hematopoiéticas e mais células estaminais, células endoteliais vasculares e alguns vasos linfáticos ^26.

VEGFR-3, o receptor para os factores de crescimento vascular endotelial C e D, é inicialmente presente nas veias do embrião de rato em desenvolvimento, mas seguinte especificação linfático regulada por factores de transcrição HMG-box relacionada-SRY (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f actor 2 (COUPTF-II) e PROX-1, VEGFR-3 expressão venosa está perdido e torna-se restrita a embrionária LECs ^25,27. Podoplanin, uma membrana de 38 kDa mucoproteína, é observado pela primeira vez em vasos linfáticos em cerca de 11 dias embrionários (~) de rato E11.0 desenvolvimento embrionário ²⁸ e enquanto ele é fortemente expresso por vasos linfáticos microvasculares, podoplanina por endotélio linfático macrocístico em malformações linfáticas é mais variável ^15. A citometria de fluxo experiências sugerem que pelo menos algumas células endoteliais CD34 CD31 ^{alta Pos} expressar o marcador linfático podoplanin ^29. Embora a avaliação sistemática de coloração LYVE-1 e podoplanin em malformações linfáticos humanos mostrou que ambos são eficazes na coloração malformação endotélio linfático ^30, em tecidos normais, LYVE-1 foi relatada como sendo fortemente presente na linfático inicialendotélio capilar, mas reduzida e até mesmo ausente no endotélio linfático coleta ^31. Como nosso objetivo é isolar tanto as células endoteliais linfáticas iniciais e de coleta, optaram por não usar LYVE-1 como parte de nossa estratégia de seleção de célula. Finalmente, a decisão de utilizar estes marcadores também baseou-se na disponibilidade de anticorpos que são utilizados diagnosticamente para a marcação de vasos linfáticos para imagem microscópica, uma característica que permita correlação entre estudos de citometria de fluxo e imunof luorescência.

Este artigo irá descrever o método de digestão de tecidos, coloração de células e configurações FACS necessário para isolamento de células CD34 CD31 ^{Baixa Pos VEGFR-3} POS podoplanin ^Pos LECs, bem como as células endoteliais CD34 CD31 ^{alta Pos} VEGFR-3 ^{Pos Pos} podoplanin do prepúcio e malformação linfática tecido.

Protocol

Declaração de Ética: A aprovação ética para a recolha de tecidos e malformação prepúcio linfáticos foi obtido a partir de Comitês de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital do Royal Children, Melbourne, Austrália. Consentimento assinado foi recebido de pais dos pacientes antes da cirurgia. As amostras de tecidos foram coletadas de pacientes com diagnóstico de LMs submetidos a procedimentos cirúrgicos, como parte de sua gestão clínica e os pacientes submetidos a circuncisão eletivo. Todos os expe…

Representative Results

Após a digestão do tecido inicial, após 24 horas em cultura de amostras não fraccionadas, as colónias de células endoteliais podem ser observadas (Figura 2A), juntamente com as células semelhantes a fibroblastos e células musculares lisas. Seguindo triagem e após 24 horas em cultura de células, as células CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 células Pos Pos podoplanina anexar e mostram a morfologia típica de calçada (Figura 2B e C). Utilizando…

Discussion

LECs desempenhar um papel importante na manutenção da homeostase dos fluidos, resposta imunitária a antigénios estranhos e a absorção e transporte de alguns nutrientes. Homeostase LEC pode ser afectada por processos de doenças, tais como infecções bacterianas e metástases de tumores, mas também pode desenvolver LECs mutações somáticas que resultam na formação de vasos linfáticos disfuncionais e morbidade significativa para os pacientes afectados. Para ganhar mais compreensão da etiologia malformação …

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalogue Number	Description
DMEM	Life Technologies (Gibco)	11965-092	Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	CC-3202	EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C	R&D Systems	2179-VC-025	Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F2006	Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent	Life Technologies (Gibco)	A11105-01	StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye	Life Technologies (Gibco)	15250-061	Used as a viability stain.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	Used at 0.04%
Collagenase II	Worthington Lab	4176	Used at 0.25%
DNase I	Roche Applied Biosciences	11284932001	Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers	BD Falcon	352350
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59	BioLegend	356204	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581	BioLegend	343516	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59	BioLegend	303116,	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.	BioLegend	337006	Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400112	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400126	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400120	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758	BioLegend	400525	Used at 1:200 dilution