Isolering af human lymfeendotelceller af Multi-parameter Fluorescens-aktiveret cellesortering
Summary
Målet med denne protokol er at isolere lymfeendotelceller foring menneskelige lymfatisk misdannelse cyste-lignende fartøjer og Forhud anvender fluorescens-cellesortering (FACS). Efterfølgende celledyrkning og udvidelse af disse celler tillader et nyt niveau af eksperimentel raffinement for genetiske, proteomiske, funktionelle og celle differentiering undersøgelser.
Abstract
Lymfesystem såsom primær Lymphedema, lymfe misdannelser og lymfe tumorer er sjældne betingelser, der forårsager betydelig sygelighed, men lidt er kendt om deres biologi. Isolere meget rene humane lymfeendotelceller (LEC) fra sygt og sundt væv vil lette undersøgelser af lymfatisk endotel på genetiske, molekylære og cellulære niveauer. Det forventes, at disse undersøgelser kan afsløre mål for nye behandlingsformer, der kan ændre den kliniske behandling af disse tilstande. En protokol, der beskriver isolering af menneskelige forhud LEC og lymfe misdannelse lymfeendotelceller (LM LEC) præsenteres. Til opnåelse af en enkelt cellesuspension væv blev hakket og enzymatisk behandlet ved anvendelse af dispase II og collagenase II. Den resulterende enkelt cellesuspension blev derefter mærket med antistoffer mod klynge af differentiering (CD) markører CD34, CD31, karendotelvækstfaktor-3 (VEGFR-3) og PODOPLANIN. Stainerede levedygtige celler blev sorteret på en fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS) for at adskille CD34 Low CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LM LEC befolkning fra andre endotel og ikke-endotelceller. De sorterede LM LEC blev dyrket og udvidet på fibronectincoatede kolber for yderligere eksperimenterende brug.
Introduction
En væsentlig funktion af det lymfatiske vaskulære system er at absorbere lymfe, et overskud interstitiel væske indeholdende lipider, proteiner og cellulære komponenter og udføre det til blodet venøse system. Et netværk af lymfe kapillærer dirigerer lymfe til lymfeknuderne, hvor det er screenet for tilstedeværelse af fremmede antigener, en vigtig proces i immun overvågning og implementering af hvide blodlegemer til at neutralisere fremmede antigener.
Uni-directional lymfesystemet starter i væv med den oprindelige lymfatisk kapillarrør, en unik struktur med diskontinuert enkelt lag af tyndvæggede flade endotelceller med specialiserede celle vejkryds, der tillader lymfeknuder post 1,2. Disse kapillærer er fastgjort til den tilstødende bindevæv matricen via forankring filamenter til forebyggelse fartøj sammenbrud i nærvær af øget interstitiel tryk 3. De indledende lymfe kapillærer tømmes i indsamling lymfe kapillærerat smelte sammen i større lymfekar eller vener. I sammenligning med indledende lymfatiske kapillærer, indsamling lymfekar har tykkere karvægge, parret lymfe ventiler og er omsluttet af en diskontinuerlig basalmembran, hvor et par glatte muskelceller er indlejret 4. Koordineret åbning og lukning af lymfatiske ventiler og sammentrækning af glatte muskelceller letter strømmen af lymfeknuder 3. Hos mennesker, de lymfatiske vener fra forskellige områder af kroppen slutte danner lymfe kufferter, der fusionerer for at danne to lymfegange: bryst ventilationskanal og retten lymfe kanal. Den thorakale kanal dræner lymfeknuder fra venstre side af kroppen og fra højre side under brystet mens højre lymfatiske kanal- afløb lymfeknuder fra højre arm og højre side af hovedet, hals og brystkasse. Begge kanaler gennemføre lymfeknuder i subclavia vener i nakken 5.
Lidelser i det lymfatiske system er stort set inddeles i erhvervet ennd medfødt (tabel 1). Eksempler på tilkøbte betingelser er lymphangitis og sekundær Lymphedema. Lymphangitis er en betændelse i en lymfekar grund af bakteriel infektion. De berørte lymfevejene spile og fyldes med eksudat indeholder polymorfonukleære celler. I hud, disse lymfekar er synlige som rød, smertefuld subkutan striber ofte ledsaget af udvidelsen af det tilhørende drænende lymfeknude (lymfadenitis) 6. Sekundær lymfeødem opstår som følge af beskadigelse eller obstruktion af lymfekar eller lymfeknude obstruktion. Dette fører til kronisk progressiv hævelse på grund af ophobning af lymfeknuder distalt for skade eller obstruktion. I de udviklede lande, er sekundær lymfeødem mest almindeligt tilknyttet malignitet hvor metastaserende tumorer hindrer lymfekar eller regionale lymfeknuder, eller som følge af anti-cancer behandling efter kirurgisk fjernelse af lymfeknuder, post-bestråling fibrose og post-inflammatorisk Thrombosis og ardannelse 7. I andre dele af verden, kan sekundær lymfeødem være sekundære til lymfatisk obstruktion forårsaget af parasitiske orme, såsom Wuchereria bancrofti 6.
| Lidelser af lymfatisk karsystemet | |||
| Erhvervet | Medfødt | ||
| Lymfadenitis Sekundær Lymphedema | Primær Lymphedema 10 | Sporadiske lymfe Misdannelser 13 | Lymfe Misdannelser associeret med syndromer 13 |
| f.eks Milroy Syndrome Meige Syndrome | Simple: Lymfe misdannelser | f.eks Klippel-Tranaunay syndrom Parker Weber syndrom Sturge-Weber syndrom | |
| Kombineret: Kapillære-lymfe misdannelser Kapillær-lymfe-venøs misdannelse Kapillær-lymfe-arteriovenøs misdannelse Kapillær-lymfatisk venøs-arteriovenøs misdannelse | |||
Tabel 1. Oversigt over sygdomme i lymfe karsystem.
Medfødte lidelser i lymfesystemet indbefatter primær (idiopatisk) lymfeødem menes at være forårsaget af genetiske mutationer, lymphangiectasia og anomalier i lymfesystemet 8,9. Primær lymfeødem kan være sporadisk formodentlig forårsaget af de novo mutationer, eller arvet. Lymfesystem kan også være isoleret eller omfatte en del af en mere generel syndrom 10. I den pædiatriske befolkning, 97% af lymfeknuderødem er sporadisk med abnormaliteter i lymfekar struktur, der forringer den regionale lymfedrænage 11. Milroy sygdom er et eksempel på primær lymfeødem forårsaget af mutation i VEGFR-3-genet tydelig ved fødslen eller lige efter 12. Selvom det meste familiær tilstand, kan Milroy sygdom også identificeres hos spædbørn uden familie historie Milroy sygdom 32. Alvorligheden af eventuelle lymfeødem er afhængig af mængden af lymfeknuder produktion og evne til at transportere lymfeknuder tilbage til venøse cirkulation 6.
Baseret på klinisk præsentation og in situ endotelcelleproliferation, er uregelmæssigheder i lymfesystemet klassificeret som lymfatiske tumorer eller lymfatiske misdannelser 13. Kaposiform lymphangiomatosis er et eksempel på en LEC tumor 14. Lymfatiske misdannelser menes at opstå under fosterudviklingen og vokse i forhold til barnet 15,16. De sjældent relatere men kan remain asymptomatisk indtil traume eller infektion udfælder hurtig vækst fører til kliniske komplikationer. Velordnet struktur af lymfatisk netværk og ledning af lymfeknuder fra vævet til venøse cirkulation beskrevet ovenfor forstyrres i lymfatiske misdannelser, der består af lokaliserede samlinger af abnorme cystiske strukturer fyldt med lymfevæske. Mens der er ingen kliniske eller eksperimentelle beviser for, at disse cystiske fartøjer er forbundet til det lymfatiske cirkulation, eller at de indeholder funktionelle lymfe ventiler, deres lymfe identitet bekræftet ved ekspression af vifte af lymfatiske cellemarkører såsom PODOPLANIN, CD31, lymfatisk Vessel Endothelial Receptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) og VEGFR-3 15,17,18. Disse cystiske strukturer kan enten være små (microcystic) eller store (macrocystic), men de fleste lymfatiske misdannelser indeholder både microcystic og macrocystic komponenter (figur 1) 16. Efter operation, injektionsvæsken sclerotherapy og / eller radiofrekvens ablation de lymfatiske misdannelser ofte opstå igen.
Figur 1. Morfologi af humane lymfekar og lymfatiske misdannelser. Normalt humant lymfe (A) og lymfe misdannelser fartøjer (B og C) er mærket med antistof mod PODOPLANIN (brun etiket, pil). Humane lymfe misdannelser skibe er præget af markant dilatation og betydelig variation i lumen størrelse. Disse lokaliserede abnorme cystiske strukturer kan enten være små (microcystic, *) (B) eller store (macrocystic, #) (C). Mest lymfe misdannelser indeholder både microcystic og macrocystic komponenter. Klik her for at se en større version af figuren. </ P>
Nogle forskere har foreslået, at lymfatiske misdannelser repræsenterer en udviklingsforstyrrelse af lymfatisk vaskulatur, hvor LEC ikke har unormal vækstpotentiale, men i stedet har undladt at forbinde til normal brug 19. Vi har imidlertid fundet, at LM LEC prolifererer hurtigere og er mere resistente over for apoptose end forhuden LEC 15 tyder på, at der er en primær defekt i LM LEC. Når LM LEC implanteres i en mus xenograft model, danner de strukturer, der minder om lymfatiske misdannelser 15. Dette understøtter en hypotese om, at lymfatiske misdannelser kan være forårsaget af en eller flere somatiske mutationer opstår i LM LEC under fosterudviklingen. Faktisk har nylige rapporter identificeret en sådan mutation i p110α katalytiske underenhed af phosphoinositid-3-kinase (PIK3CA) gen 20.
I betragtning af de fremskridt inden for DNA-sekventering teknologi, relevante mutationer could være mere let identificeres i isolerede LM LEC, vejlede fremtidige studier af disse betingelser. Isolering af levedygtige LEC vil lette sammenligninger mellem abnorme og normale LEC i assays, såsom migration, spredning, rør danner evne og overlevelse som reaktion på reduceret tilgængelighed af næringsstoffer eller pro-apoptotiske agenter 15. Isolerede LEC vil yderligere gøre det muligt at udføre celle-specifikke genekspression og proteomiske undersøgelser, at afgrænse nye LEC subpopulationer og opdage nye farmakologiske midler, der er egnede til klinisk håndtering af lymfatiske misdannelser.
Vi har tidligere udgivet en LEC isolation metode baseret på magnetisk perle adskillelse af LEC fra neonatal forhud og lymfe misdannelser 15. Vi rapporteret en strategi for at adskille normale og syge LEC fra vaskulære endotelceller baseret på fravær af CD34-ekspression, efterfulgt ved at udsætte CD34 Neg fraktion celle til positiv selektion for CD31.Imidlertid blev denne metode hæmmet af tilstedeværelsen af resterende ikke-endotelceller. Dette var uafhængigt af fjerne epidermis inden efterfølgende bindevæv fordøjelse. Disse forureninger generelt spredt hurtigere og dermed i sidste ende overgrew de endotel cellekulturer trods efterfølgende forsøg på at gentage LEC isolation. Faktisk en indledende forurening af ikke-endotelceller så lave som 2% til 5% var tilstrækkelig til at overvælde LEC befolkning 15. Det fik os til at udforske fluorescens cellesortering metode som en mulighed for at forbedre LEC celle udbytte og renhed. Derudover brugte vi flere parameter sortering at øge specificiteten af de LEC befolkninger, tilføjer VEGFR-3 og PODOPLANIN til udvælgelse markører til at identificere CD34 Low CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LEC.
Begrundelsen for at vælge disse markører var baseret på de rapporter, mens LEC og blod vaskulær endotel ceLLS have mange celleoverflademarkører fælles såsom CD31, LEC viser fænotypisk variation i deres ekspression af CD34, PODOPLANIN og VEGFR-3 celleoverflademarkør sammenlignet med blod vaskulære endotelceller 21-23. CD31 er et 130 kDa transmembrant glycoprotein også kendt som blodplade endotelial celleadhæsion molekyle 1 (PECAM-1). Det anses for at være en pan-endotelcelle-pen, der er udtrykt på alle typer af blod- og lymfekar 21,24,25. CD34 er 110 kDa transmembrane glycoprotein stede på de fleste hæmatopoietiske og stamceller, vaskulære endothelceller og nogle lymfekar 26.
VEGFR-3, receptoren for vaskulær endothelial vækstfaktorer C og D, er oprindeligt til stede på udviklingslandene vener i muse embryo, men efter lymfe specifikation reguleret af transkriptionsfaktorer SRY-beslægtet HMG-box (SOX) -18, c Hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f skuespiller 2 (COUPTF-II) og PROX-1 er VEGFR-3 venøs udtryk tabt, og det bliver begrænset til embryonale LEC 25,27. PODOPLANIN, en 38 kDa-membran bemærkes mucoprotein, først på lymfekar ved ca. embryonale dag 11 (~ E11.0) af mus fosterudvikling 28 og mens det er stærkt udtrykt af mikrovaskulære lymfekar, PODOPLANIN udtryk ved macrocystic lymfatisk endotel i lymfe misdannelser er mere variabel 15. Flowcytometri forsøg antyder, at i det mindste nogle CD34 High CD31 Pos endotelceller udtrykker det lymfatiske markør PODOPLANIN 29. Selv om systematisk vurdering af LYVE-1 og PODOPLANIN farvning i humane lymfatiske misdannelser viste, at både er effektive til farvning lymfatisk endotel misdannelse 30, i normale væv, LYVE-1 blev rapporteret at være stærkt til stede i den oprindelige lymfekapillærendotelet men reduceres og endog fraværende i indsamling lymfatisk endotel 31. Da vores mål er at isolere både de indledende og indsamling lymfeendotelceller vi har valgt ikke at bruge LYVE-1 som en del af vores udvalg celle strategi. Endelig blev beslutningen om at ansætte disse markører også baseret på tilgængeligheden af antistoffer, der bruges diagnostisk til mærkning lymfekar til mikroskopisk billeddannelse, en funktion, der gør det muligt sammenhæng mellem flowcytometri og immunfluorescerende studier.
Denne artikel vil beskrive vævet fordøjelsesmetode, cellefarvning og FACS indstillinger, der kræves for en vellykket isolering af CD34 Low CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LEC samt CD34 High CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos endotelceller fra forhud og lymfe misdannelser væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
LEC spiller en vigtig rolle i at opretholde væske homeostase, immunrespons på fremmede antigener og absorption og transport af visse næringsstoffer. LEC homeostase kan påvirkes af sygdomsprocesser, såsom bakterielle infektioner og tumormetastase, men LEC kan også udvikle somatiske mutationer, der resulterer i dannelsen af dysfunktionelle lymfekar og betydelig sygelighed for de ramte patienter. For at få mere forståelse af lymfatisk misdannelser ætiologi gennem in vivo implantation og ex vivo<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Baker Foundation og Royal Børns Foundation 'Women in Science Fellowship' støtte til Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty og Edouard G. Stanley er NHMRC Senior Research Fellows. Arbejde i deres laboratorier blev støttet af NHMRC og Stamceller Australien.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Description |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 | |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
References
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).
- Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).
- Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).
- Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
- Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. . Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, (2009).
- Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).
- . . Mulliken & Young’s Vascular Anomalies Hemangiomas and. , 1059-1076 (2013).
- . . Mulliken & Young’s Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, 562-594 (2013).
- Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
- Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).
- Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).
- . for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).
- Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).
- Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).
- Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).
- Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).
- Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).
- Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. . 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , (2014).
- Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).
- Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).
- Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
- Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).
- Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).
- Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).
- Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).
- Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).
- Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).
