Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Summary

L'objectif de ce protocole est d'isoler les cellules endothéliales lymphatiques qui tapissent malformation lymphatique navires et prépuces kystiques humains en utilisant des cellules activées par fluorescence (FACS). La culture de cellules et de l'expansion ultérieure de ces cellules permet un nouveau niveau de sophistication expérimental pour les études génétiques, protéomiques, fonctionnels et de différenciation cellulaire.

Abstract

Troubles du système lymphatique tels que le lymphoedème primaire, malformations lymphatiques et les tumeurs lymphatiques sont des conditions rares qui causent une morbidité significative, mais peu de choses sont connues sur leur biologie. Isoler des cellules lymphatiques humaines très pures endothéliales (ESL) à partir de tissus malades et en bonne santé serait de faciliter les études de l'endothélium lymphatique aux niveaux génétiques, moléculaires et cellulaires. Il est prévu que ces enquêtes peuvent révéler des cibles pour de nouvelles thérapies qui peuvent changer la gestion clinique de ces conditions. Un protocole décrivant l'isolement de prépuce humain ESL et malformation lymphatique de cellules endothéliales lymphatiques (LM ESL) est présenté. Pour obtenir un tissu de la suspension de cellules a été hachée et traitée par voie enzymatique en utilisant de la collagénase et la dispase II II. La suspension cellulaire unique résultant a été ensuite marqué avec des anticorps à grappe de différenciation (CD) marqueurs CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) et podoplanin. Stailes cellules viables ont été triées nies sur un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS) pour séparer le CD34 CD31 ^faible VEGFR-3 ^{Pos Pos} population podoplanin ^Pos LM LEC autre endotheliales et de cellules non endotheliales. Les ESL LM triées ont été cultivées et élargi de flacons revêtues de fibronectine pour un usage plus expérimentale.

Introduction

Une fonction importante du système vasculaire lymphatique est d'absorber la lymphe, un excès de liquide interstitiel contenant des lipides, des protéines et des composants cellulaires, et la conduire vers le système veineux sanguin. Un réseau de capillaires lymphatiques lymphatiques dirige vers les ganglions lymphatiques où il est criblée pour la présence d'antigènes étrangers, un processus important dans la surveillance immunitaire et le déploiement de globules blancs pour neutraliser les antigènes étrangers.

Le système lymphatique unidirectionnelle dans des tissus commence avec le capillaire lymphatique initiale, une structure unique d'une couche unique de cellules endotheliales discontinue plates à paroi mince avec des jonctions de cellules spécialisées qui permettent la saisie de la lymphe ^1,2. Ces capillaires sont fixés à la matrice du tissu conjonctif voisin par l'intermédiaire d'ancrage des filaments pour empêcher l'effondrement de la cuve en présence d'augmentation de la pression interstitielle ^3. Les capillaires lymphatiques premiers vides dans la collecte des capillaires lymphatiquesqui confluent en vaisseaux lymphatiques ou des veines plus grandes. En comparaison initiale vaisseaux capillaires lymphatiques, les vaisseaux lymphatiques ont collecter plus épaisses parois des vaisseaux lymphatiques, des soupapes jumelées et sont enfermés par une membrane basale discontinue dans laquelle quelques cellules de muscle lisse sont noyés ^4. Universel Coordonné ouverture et la fermeture des vannes lymphatiques et la contraction des cellules musculaires lisses facilite l'écoulement de lymphe ^3. Chez les humains, les veines lymphatiques provenant de diverses régions du corps se rejoignent pour former troncs lymphatiques qui fusionnent pour former deux canaux lymphatiques: le canal thoracique et le canal lymphatique droit. Le canal thoracique draine la lymphe du côté gauche du corps et de la droite en dessous de la poitrine tandis que la droite lymphatique drains de conduit lymphe du bras droit et sur le côté droit de la tête, du cou et du thorax. Les deux conduits mènent lymphe dans les veines sous-clavière dans le cou ^5.

Troubles du système lymphatique sont regroupés en un acquise congénitale (Tableau 1). Des exemples de conditions sont acquises lymphangite et lymphoedème secondaire. Lymphangitis est une inflammation d'un vaisseau lymphatique due à une infection bactérienne. Les lymphatiques touchés se dilatent et se remplissent de polynucléaires contenant de l'exsudat. Dans la peau, ces vaisseaux lymphatiques sont visibles en rouge, stries sous-cutanée douloureuse souvent accompagnée par l'élargissement du noeud associé drainage lymphatique (adénopathie) ^6. Le lymphoedème secondaire se pose comme une conséquence des dommages ou une obstruction à la cuve ou des ganglions lymphatiques obstruction lymphatique. Cela conduit à un gonflement chronique progressive due à l'accumulation de lymphe distale au dommage ou obstruction. Dans les pays développés, lymphoedème secondaire est le plus souvent associé à la malignité des tumeurs où des métastases obstruent les vaisseaux lymphatiques ou ganglions lymphatiques régionaux, ou comme une conséquence de la thérapie anti-cancer après l'ablation chirurgicale des ganglions lymphatiques, la fibrose post-irradiation et Throm post-inflammatoirebose et des cicatrices ^7. Dans d'autres régions du monde, le lymphoedème secondaire peut être secondaire à une obstruction lymphatique causée par des vers parasites tels que Wuchereria bancrofti ^6.

Troubles du système lymphatique vasculaire
Acquis	Congénital
Lymphadénite Le lymphoedème secondaire	Le lymphoedème primaire 10	Sporadiques malformations lymphatiques 13	Lymphatique malformations associées à des syndromes 13
	par exemple, Syndrome Milroy Syndrome de Meige	Simple: Malformations lymphatiques	par exemple, Syndrome de Klippel-Tranaunay Syndrome Weber Parcs Syndrome de Sturge-Weber
		Combiné: malformations capillaires-lymphatique Malformation capillaire lymphatique-veineuse Malformation capillaire lymphatique-artérioveineuse Capillaire lymphatique malformation veineuse-artérioveineuse

Tableau 1. Aperçu des troubles du système vasculaire lymphatique.

Affections congénitales du système lymphatique comprennent primaire (idiopathique) lymphoedème pensé pour être causée par des mutations génétiques, lymphangiectasie et les anomalies du système lymphatique de ^8,9. Lymphoedème primaire peut être sporadique vraisemblablement causée par des mutations de novo, ou hérité. Troubles lymphatiques peut aussi être isolé ou comprendre une partie d'un syndrome plus généralisé ^10. Dans la population pédiatrique, 97% de la lympheœdème est sporadique à des anomalies dans la structure des vaisseaux lymphatiques qui nuisent drainage lymphatique régional ^11. Maladie Milroy est un exemple de lymphoedème primaire causée par une mutation dans le gène VEGFR-3 évidents à la naissance ou peu après ^12. Bien que la plupart du temps l'état familial, la maladie Milroy peut également être identifié chez les nourrissons sans antécédents familiaux de la maladie Milroy ^32. La gravité de tout le lymphœdème est fonction de la quantité de production de la lymphe et la capacité de transporter lymphe retour à la circulation veineuse ^6.

En fonction du tableau clinique et in situ prolifération des cellules endotheliales, des anomalies du système lymphatique sont classés comme des tumeurs ou malformations lymphatiques lymphatiques ^13. Kaposiforme lymphangiomatose est un exemple d'une tumeur ¹⁴ LEC. Malformations lymphatiques sont pensés pour survenir au cours du développement embryonnaire et de croître en proportion de l'enfant ^15,16. Ils régressent rarement mais peuvent REMAIn asymptomatique jusqu'à un traumatisme ou une infection précipités croissance rapide conduisant à des complications cliniques. La structure ordonnée du réseau lymphatique et la conduction de la lymphe du tissu à la circulation veineuse décrite ci-dessus est perturbé dans les malformations lymphatiques qui se composent de collections localisées de structures anormales kystiques remplies de liquide lymphatique. Bien qu'il n'y ait aucune preuve clinique ou expérimentale que ces navires kystiques sont reliés à la circulation lymphatique ou qu'ils contiennent des valvules lymphatiques fonctionnels, leur identité lymphatique est confirmée par l'expression de la gamme de marqueurs de cellules lymphatiques tels que podoplanin, CD31, lymphatique navire endothéliale Receptor 1 (LYVE-1), Prospero protéine homéoboîte 1 (PROX-1) et VEGFR-3 ^15,17,18. Ces structures kystiques peuvent être soit petite (microkystique) ou grande (macrokystique), mais la plupart des malformations lymphatiques contenir à la fois microkystique et composants macrokystiques (figure 1) ^16. Après la chirurgie, injection sclérothérapie et / ou l'ablation par radiofréquence les malformations lymphatiques se reproduisent souvent.

Figure 1. Morphologie des vaisseaux lymphatiques humaines et malformations lymphatiques. Lymphatique humain normal (A) et les vaisseaux lymphatiques de malformation (B et C) marqués avec des anticorps à podoplanin (étiquette brune, flèche). Vaisseaux lymphatiques malformations humaines sont caractérisées par une dilatation marquée et une variation considérable dans la taille de la lumière. Ces structures kystiques anormales localisées peuvent être soit petite (microkystique, *) (B) ou grande (macrokystique, #) (C). La plupart des malformations lymphatiques contiennent des composants microkystiques et macrokystiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure. </ P>

Certains chercheurs ont suggéré que les malformations lymphatiques représentent un trouble du développement de la vascularisation lymphatique dans lequel les ESL ne présentent un potentiel de croissance anormale mais ont échoué à se connecter à la circulation normale ^19. Cependant, nous avons constaté que les ESL LM prolifèrent plus rapidement et sont plus résistantes à l'apoptose de prépuce ESL ¹⁵ qui suggère qu'il ya un défaut primaire dans le LM ESL. Quand LM ESL sont implantées dans un modèle de xénogreffe de souris, ils forment des structures qui rappellent malformations lymphatiques ^15. Cela confirme l'hypothèse selon laquelle les malformations lymphatiques peuvent être causés par une ou plusieurs mutations somatiques provenant de LM ESL au cours du développement foetal. En effet, des rapports récents ont identifié une telle mutation dans la sous-unité catalytique p110 de phosphoinositide 3-kinase (PIK3CA) gène ^20.

Compte tenu des progrès de la technologie de séquençage de l'ADN, des mutations pertinentes could être plus facilement identifiés dans isolées LM ESL, guider les futures études de ces conditions. L'isolement des ESL viables serait de faciliter les comparaisons entre les ESL anormales et normales dans des dosages tels que la migration, la prolifération, tube formant capacité et la survie en réponse à la disponibilité réduite des nutriments ou des agents pro-apoptotiques ^15. ESL isolées seraient en outre nous permettre d'effectuer l'expression du gène spécifique des cellules et des études protéomiques, pour délimiter de nouveaux sous-populations de LEC et de découvrir de nouveaux agents pharmacologiques appropriés pour la gestion clinique des malformations lymphatiques.

Nous avons déjà publié une méthode d'isolement LEC basé sur la séparation des billes magnétiques des ESL de prépuce néonatal et malformations lymphatiques ^15. Nous avons rapporté une stratégie de séparation ESL normales et pathologiques à partir de cellules endothéliales vasculaires sur la base de l'absence d'expression de CD34, puis en soumettant la fraction de cellules CD34 ^Neg à une sélection positive pour CD31.Cependant, cette méthode a été entravée par la présence de cellules non endotheliales résiduels. Ceci est indépendant de l'élimination subséquente épiderme avant digestion du tissu conjonctif. Ces contaminants ont proliféré généralement plus rapidement, et donc éventuellement overgrew les cultures de cellules endothéliales, malgré les tentatives ultérieures de répéter LEC isolement. En effet, une contamination initiale de cellules non endotheliales aussi faibles que 2% à 5% est suffisante pour submerger la population ¹⁵ LEC. Cela nous a incité à explorer la méthode de tri cellulaire par fluorescence activé comme une option pour améliorer le rendement des cellules LEC et la pureté. En outre, nous avons utilisé plusieurs paramètres de tri pour améliorer la spécificité des populations LEC, ajoutant VEGFR-3 et podoplanin aux marqueurs de sélection pour identifier CD34 CD31 ^{faible Pos} VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos ESL.

La justification du choix de ces marqueurs a été basé sur les rapports que si les ESL et vasculaire endothéliale de sang CElls ont de nombreux marqueurs de surface de cellule en commun, tels que CD31, ESL montrer variation phénotypique dans leur expression de CD34, podoplanin et VEGFR-3 marqueur de surface cellulaire par rapport aux cellules endothéliales vasculaires sanguines ^21-23. CD31 est une glycoprotéine transmembranaire de 130 kDa également connu sous le nom plaquettes molécule d'adhésion des cellules endotheliales 1 (PECAM-1). Il est considéré comme un marqueur de cellules pan-endothélial, car il est exprimé sur tous types de vaisseaux sanguins et lymphatiques ^21,24,25. CD34 est de 110 kDa glycoprotéine transmembranaire présente sur progénitrices hématopoïétiques les plus et les cellules souches, les cellules endothéliales vasculaires et certains vaisseaux lymphatiques ^26.

VEGFR-3, le récepteur pour la croissance de l'endothélium vasculaire Facteurs de C et D, est initialement présent sur ​​les veines en développement dans l'embryon de souris, mais la boîte HMG SRY liés spécification suivante lymphatique régulée par les facteurs de transcription (SOX) -18, c Hicken o u valbumin pstream p t romoter ranscription f acteur 2 (COUPTF-II) et PROX-1, VEGFR-3 expression veineux est perdue et il devient restreint à ESL ^25,27 embryonnaire. Podoplanin, une membrane 38 kDa mucoprotéine, est d'abord noté sur les vaisseaux lymphatiques à environ embryonnaires de 11 jours (~ de E11.0) de la souris développement embryonnaire ²⁸ et tandis qu'il est fortement exprimé par microvasculaires vaisseaux lymphatiques, podoplanin expression par l'endothélium lymphatique macrokystique des malformations lymphatiques est plus variable ^15. La cytométrie en flux expériences suggèrent qu'au moins certaines des cellules endotheliales CD34 CD31 ^{haut Pos} expriment le marqueur podoplanin ²⁹ lymphatique. Bien que l'évaluation systématique des LYVE-1 et podoplanin coloration des malformations lymphatiques humaines a montré que les deux sont efficaces à coloration lymphatique malformation endothélium ^30, dans les tissus normaux, LYVE-1 a été signalé à être fortement présente dans le système lymphatique initialeendothélium capillaire, mais réduite et même absent dans l'endothélium lymphatique collecte ^31. Comme notre objectif est d'isoler à la fois les cellules endothéliales lymphatiques initiaux et la collecte, nous avons choisi de ne pas utiliser LYVE-1 dans le cadre de notre stratégie de sélection de cellule. Enfin, la décision d'employer ces marqueurs était également fondée sur la disponibilité d'anticorps qui sont utilisés pour l'étiquetage diagnostique vaisseaux lymphatiques pour l'imagerie microscopique, une fonctionnalité qui permettrait corrélation entre la cytométrie en flux et des études d'immunofluorescence.

Cet article décrit la méthode de digestion du tissu, la coloration des cellules et les paramètres FACS nécessaire pour permettre l'isolement de cellules CD34 ^Faible CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos ESL ainsi que les cellules endothéliales CD34 ^haut CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos du prépuce et une malformation lymphatique tissu.

Protocol

Déclaration éthique: approbation éthique pour la collecte des tissus de malformation du prépuce et lymphatiques a été obtenu à partir des comités d'éthique de la recherche de l'homme à l'Hôpital de Royal Children, Melbourne, Australie. Consentement signé a été reçu par les parents de patients avant la chirurgie. Des échantillons de tissus ont été prélevés chez des patients diagnostiqués avec LM subissant des interventions chirurgicales dans le cadre de leur prise en charge clinique et le…

Representative Results

Après la digestion de tissu initial, après 24 heures de culture dans des échantillons non fractionnés, des colonies de cellules endotheliales distinctes peuvent être observées (figure 2A) avec des cellules de type fibroblaste et les cellules musculaires lisses. Après le tri et après 24 heures de culture de cellules, les cellules CD34 CD31 faible Pos VEGFR-3 cellules Pos podoplanin Pos attacher et montrer la morphologie pavée typique (figure 2B e…

Discussion

ESL jouent un rôle important dans le maintien de l'homéostasie fluide, la réponse immunitaire à des antigènes étrangers et l'absorption et le transport de certains nutriments. Homéostasie LEC peut être affectée par des processus pathologiques tels que les infections bactériennes et les métastases tumorales, mais peut aussi se développer ESL mutations somatiques qui se traduisent par la formation de vaisseaux lymphatiques dysfonctionnelles et une morbidité significative pour les patients affectés. P…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalogue Number	Description
DMEM	Life Technologies (Gibco)	11965-092	Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	CC-3202	EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C	R&D Systems	2179-VC-025	Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F2006	Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent	Life Technologies (Gibco)	A11105-01	StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye	Life Technologies (Gibco)	15250-061	Used as a viability stain.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	Used at 0.04%
Collagenase II	Worthington Lab	4176	Used at 0.25%
DNase I	Roche Applied Biosciences	11284932001	Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers	BD Falcon	352350
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59	BioLegend	356204	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581	BioLegend	343516	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59	BioLegend	303116,	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.	BioLegend	337006	Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400112	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400126	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400120	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758	BioLegend	400525	Used at 1:200 dilution