मल्टी पैरामीटर प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा मानव लिम्फेटिक endothelial कोशिकाओं का अलगाव
Summary
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग मानव लसीका कुरूपता पुटी-तरह के जहाजों और foreskins अस्तर लसीका endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए है। इसके बाद सेल संवर्धन और इन कोशिकाओं के विस्तार, आनुवंशिक प्रोटिओमिक, कार्यात्मक और सेल भेदभाव के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक मिलावट के एक नए स्तर परमिट।
Abstract
ऐसे प्राथमिक lymphedema, लसीका विकृतियों और लसीका ट्यूमर के रूप में लसीका प्रणाली विकारों महत्वपूर्ण रुग्णता का कारण है, लेकिन थोड़ा उनके जीव विज्ञान के बारे में जाना जाता है कि दुर्लभ स्थितियों रहे हैं। रोगग्रस्त और स्वस्थ ऊतकों से अत्यधिक शुद्ध मानव लसीका endothelial कोशिकाओं (LECs) अलग, आनुवंशिक आणविक और सेलुलर स्तर पर लसीका अन्तःचूचुक के अध्ययन की सुविधा होगी। यह इन जांच के लिए इन शर्तों के नैदानिक प्रबंधन परिवर्तित हो सकता है कि नए उपचार के लिए लक्ष्य प्रकट हो सकता है कि अनुमान है। LECs और लसीका कुरूपता लसीका endothelial कोशिकाओं (एल एम LECs) चमड़ी मानव के अलगाव का वर्णन एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। प्राप्त करने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन ऊतक कीमा और enzymatically dispase द्वितीय और collagenase द्वितीय का उपयोग कर इलाज किया गया था। जिसके परिणामस्वरूप एकल कक्ष निलंबन फिर भेदभाव (सीडी) मार्कर CD34, CD31, संवहनी endothelial वृद्धि कारक-3 (VEGFR-3) और PODOPLANIN के क्लस्टर के लिए एंटीबॉडी के साथ चिह्नित किया गया। Staiनेड व्यवहार्य कोशिकाओं अन्य endothelial और गैर endothelial कोशिकाओं से CD34 कम CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति एलएम LEC आबादी को अलग करने के लिए एक fluorescently सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) पर हल किया गया। छाँटे गए एलएम LECs सुसंस्कृत थे और आगे प्रयोगात्मक उपयोग के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन-लेपित बोतल पर विस्तार किया।
Introduction
लसीका नाड़ी तंत्र का एक प्रमुख समारोह लसीका, लिपिड, प्रोटीन और सेलुलर घटकों से युक्त एक अतिरिक्त मध्य द्रव को अवशोषित, और रक्त शिराओं व्यवस्था करने के लिए यह आचरण है। लसीका केशिकाओं का एक नेटवर्क है यह विदेशी एंटीजन, प्रतिरक्षा निगरानी और विदेशी एंटीजन को बेअसर करने के लिए सफेद रक्त कोशिकाओं की तैनाती में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया की उपस्थिति के लिए जांच की है, जहां लिम्फ नोड्स के लिए लिम्फ निर्देशन।
ऊनि दिशात्मक लसीका प्रणाली प्रारंभिक लसीका केशिका, लिम्फ प्रविष्टि 1,2 की अनुमति है कि विशेष सेल जंक्शनों के साथ पतली दीवारों फ्लैट endothelial कोशिकाओं की एक असंतत एक परत के साथ एक अद्वितीय संरचना के साथ ऊतकों में शुरू होता है। ये केशिकाओं वृद्धि हुई मध्य दबाव 3 की उपस्थिति में पोत पतन को रोकने के लिए filaments के प्रस्तोता के माध्यम से पड़ोसी संयोजी ऊतक मैट्रिक्स से जुड़े होते हैं। लसीका केशिकाओं संग्रह में खाली प्रारंभिक लसीका केशिकाओंकि बड़ा लसीका वाहिकाओं या नसों में संगठित होना। इसकी तुलना में लसीका वाहिकाओं मोटा वाहिनियों की दीवारों, बनती लसीका वाल्व है और कुछ चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं 4 एम्बेडेड रहे हैं, जिसमें एक असंतत तहखाने झिल्ली से encased हैं इकट्ठा करने, लसीका केशिका वाहिकाओं प्रारंभिक। चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के समन्वित खोलने और लसीका वाल्व को बंद करने और संकुचन लिम्फ 3 के प्रवाह की सुविधा। वक्ष वाहिनी और सही लसीका वाहिनी: मनुष्यों में, शरीर के विभिन्न क्षेत्रों से लसीका नसों दो लसीका नलिकाओं के लिए फार्म का विलय जो लसीका चड्डी फार्म करने के लिए शामिल हो। वक्ष वाहिनी छाती के नीचे शरीर के बाईं ओर से और दाईं ओर से लसीका नालियों जबकि सिर, गर्दन और छाती के दाहिने हाथ और दाईं ओर से सही लसीका वाहिनी नालियों लिम्फ। दोनों नलिकाओं गर्दन 5 में अवजत्रुकी नसों में लिम्फ आचरण।
लसीका प्रणाली के विकार को मोटे तौर पर हासिल कर ली एक में बांटा जाता हैएन डी जन्मजात (1 टेबल)। का अधिग्रहण शर्तों के उदाहरण लसिकावाहिनीशोथ और माध्यमिक lymphedema हैं। लसिकावाहिनीशोथ कारण बैक्टीरिया के संक्रमण के लिए एक लसीका पोत की सूजन है। प्रभावित lymphatics चौड़ा करना और पीब युक्त polymorphonuclear कोशिकाओं के साथ भरें। त्वचा में, इन lymphatics अक्सर जुड़े draining लिम्फ नोड (लिम्फाडेनिटिस) 6 की वृद्धि के साथ लाल, दर्दनाक चमड़े के नीचे धारियाँ के रूप में दिखाई दे रहे हैं। माध्यमिक lymphedema लसीका पोत या लिम्फ नोड रुकावट के लिए क्षति या रुकावट का एक परिणाम के रूप में उठता है। इस वजह से क्षति या रुकावट के लिए लिम्फ डिस्टल के संचय के लिए पुरानी प्रगतिशील सूजन हो जाती है। विकसित देशों में, माध्यमिक lymphedema सबसे सामान्यतः metastasizing ट्यूमर लसीका वाहिकाओं या क्षेत्रीय लिम्फ नोड्स में बाधा डालती है, या एंटी-कैंसर के उपचार का एक परिणाम के रूप में लिम्फ नोड्स, के बाद विकिरण फाइब्रोसिस और पोस्ट भड़काऊ throm के सर्जिकल हटाने के बाद जहां दुष्टता के साथ जुड़ा हुआ हैbosis और scarring 7। दुनिया के अन्य भागों में, माध्यमिक lymphedema ऐसे Wuchereria bancrofti के रूप में 6 परजीवी कीड़े की वजह से लसीका रुकावट के लिए माध्यमिक हो सकता है।
| लिम्फेटिक नाड़ी तंत्र के विकार | |||
| प्राप्त | जन्मजात | ||
| लिम्फाडेनिटिस माध्यमिक lymphedema | प्राथमिक lymphedema 10 | छिटपुट लिम्फेटिक विकृतियां 13 | सिंड्रोम 13 के साथ लसीका विकृतियों एसोसिएटेड |
| जैसे Milroy सिंड्रोम Meige सिंड्रोम | सरल: लिम्फेटिक विकृतियां | जैसे Klippel-Tranaunay सिंड्रोम पार्क वेबर सिंड्रोम Sturge-वेबर सिंड्रोम | |
| संयुक्त: केशिका-लसीका विकृतियों केशिका-लसीका-शिरापरक कुरूपता केशिका-लसीका-धमनी कुरूपता केशिका-लसीका शिरापरक-धमनी कुरूपता | |||
लसीका नाड़ी तंत्र के विकारों की तालिका 1. अवलोकन।
लसीका प्रणाली के जन्मजात विकारों आनुवंशिक परिवर्तन, lymphangiectasia और लसीका प्रणाली 8,9 की विसंगतियों की वजह से होने लगा प्राथमिक (इडियोपैथिक) lymphedema शामिल हैं। प्राथमिक lymphedema संभवतः डी नोवो म्यूटेशन के कारण, या विरासत में मिला छिटपुट हो सकता है। लिम्फेटिक विकार भी अलग हो सकता है या एक अधिक सामान्यीकृत सिंड्रोम 10 के भाग के शामिल कर सकते हैं। लसीका के बाल चिकित्सा आबादी में 97%शोफ क्षेत्रीय लिम्फ जल निकासी 11 क्षीण कि लसीका वाहिका संरचना में असामान्यताओं के साथ छिटपुट है। Milroy बीमारी जन्म के समय स्पष्ट या बाद जल्द ही 12 VEGFR-3 जीन में उत्परिवर्तन के कारण प्राथमिक lymphedema का एक उदाहरण है। ज्यादातर पारिवारिक हालत हालांकि, Milroy रोग भी Milroy बीमारी 32 के परिवार के इतिहास के बिना शिशुओं में पहचाना जा सकता है। किसी भी lymphedema की गंभीरता लिम्फ उत्पादन और शिरापरक संचलन से 6 लिम्फ वापस करने के लिए परिवहन की क्षमता की मात्रा पर निर्भर है।
नैदानिक प्रस्तुति पर और सीटू endothelial सेल प्रसार में आधार पर, लसीका प्रणाली की विसंगतियों लसीका ट्यूमर या लसीका विकृतियों 13 के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं। Kaposiform lymphangiomatosis एक LEC ट्यूमर 14 का एक उदाहरण है। लिम्फेटिक विकृतियां भ्रूण के विकास के दौरान पैदा होती है और बच्चे 15,16 के अनुपात में विकसित करने के लिए लगा रहे हैं। वे शायद ही कभी निकासी लेकिन remai कर सकते हैंएन स्पर्शोन्मुख आघात या संक्रमण नैदानिक जटिलताओं के लिए अग्रणी तेजी से विकास precipitates तक। ऊपर वर्णित शिरापरक संचलन के लिए ऊतक से लसीका नेटवर्क और लसीका के चालन के अर्दली संरचना लसीका तरल पदार्थ से भरा असामान्य सिस्टिक संरचनाओं के स्थानीय संग्रह से मिलकर बनता है जो लसीका विकृतियों में आनाकानी कर रहा है। इन सिस्टिक जहाजों वे कार्यात्मक लसीका वाल्व होते हैं कि लसीका परिसंचरण से जुड़ा है या कर रहे हैं कि कोई नैदानिक या प्रयोगात्मक सबूत नहीं है, वहीं उनके लसीका पहचान ऐसे PODOPLANIN, CD31, लसीका पोत अंतर्कलीय रिसेप्टर 1 के रूप में लसीका सेल मार्कर की सीमा की अभिव्यक्ति के द्वारा की पुष्टि की है (LYVE-1), प्रोस्पेरो homeobox प्रोटीन 1 (प्रोक्स -1) और VEGFR -3 15,17,18। ये पित्ताशय संरचनाओं या तो छोटे (microcystic) या बड़े (macrocystic) हो सकता है, लेकिन सबसे लसीका विकृतियों microcystic और macrocystic घटकों (चित्रा 1) 16 दोनों होते हैं। सर्जरी के बाद, injectioएन sclerotherapy और / या रेडियोफ्रीक्वेंसी लसीका विकृतियों अक्सर reoccur पृथक।
मानव लसीका वाहिकाओं और लसीका विकृतियों के चित्रा 1. आकृति विज्ञान है। सामान्य मानव लसीका (ए) और PODOPLANIN करने के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल लसीका कुरूपता वाहिकाओं (बी और सी) (भूरे रंग का लेबल, तीर)। मानव लसीका कुरूपता जहाजों के रूप में चिह्नित फैलाव और लुमेन आकार में काफी भिन्नता की विशेषता है। ये सभी स्थानीयकृत असामान्य सिस्टिक संरचनाओं छोटे (microcystic, *) (बी) या बड़े (macrocystic, #) (सी) या तो किया जा सकता है। अधिकांश लसीका विकृतियों दोनों microcystic और macrocystic घटक होते हैं। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ P>
कुछ जांचकर्ताओं लसीका विकृतियों LECs असामान्य वृद्धि संभावित नहीं है, लेकिन बजाय सामान्य परिसंचरण 19 से कनेक्ट करने में विफल रहा है, जिसमें लसीका वाहिका संरचना के विकास संबंधी विकार का प्रतिनिधित्व करते हैं कि सुझाव दिया है। हालांकि, हम एल एम LECs तेजी पैदा करना और LECs 15 एलएम LECs में एक प्राथमिक दोष यह है कि वहाँ का सुझाव दे चमड़ी की तुलना में एपोप्टोसिस के लिए प्रतिरोधी हो पाया है। एलएम LECs एक माउस xenograft मॉडल में प्रत्यारोपित किया जाता है, वे लसीका विकृतियों 15 की याद ताजा संरचनाओं के रूप में। इस लसीका विकृतियों भ्रूण के विकास के दौरान एल एम LECs में उत्पन्न होने वाली एक या अधिक दैहिक म्यूटेशन के कारण हो सकता है कि एक परिकल्पना का समर्थन करता है। दरअसल, हाल ही में रिपोर्ट Phosphoinositide-3-kinase (PIK3CA) जीन 20 की p110α उत्प्रेरक सबयूनिट में ऐसे ही एक उत्परिवर्तन की पहचान की है।
डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी, प्रासंगिक म्यूटेशन ग के क्षेत्र में प्रगति को देखते हुएould और अधिक आसानी से इन शर्तों के भविष्य के अध्ययन मार्गदर्शक, पृथक एलएम LECs में पहचाना जा। व्यवहार्य LECs के अलगाव कम पोषक तत्वों की उपलब्धता या समर्थक apoptotic एजेंट 15 के जवाब में इस तरह के प्रवास, प्रसार, ट्यूब बनाने की क्षमता और अस्तित्व के रूप में assays में असामान्य और सामान्य LECs के बीच तुलना की सुविधा होगी। पृथक LECs आगे नए LEC के उप-जनसंख्या चित्रित करने के लिए, सेल विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति और प्रोटिओमिक अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए सक्षम और लसीका विकृतियों के नैदानिक प्रबंधन के लिए उपयुक्त उपन्यास औषधीय एजेंटों की खोज करेंगे।
हम पहले नवजात चमड़ी और लसीका विकृतियों 15 से LECs के चुंबकीय मनका जुदाई के आधार पर एक LEC अलगाव विधि प्रकाशित किया है। हम CD31 के लिए सकारात्मक चयन करने के लिए CD34 Neg सेल अंश को subjecting द्वारा पीछा CD34 अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति पर आधारित संवहनी endothelial कोशिकाओं से सामान्य और रोगग्रस्त LECs को अलग करने की एक रणनीति की सूचना दी।हालांकि, इस पद्धति अवशिष्ट गैर endothelial कोशिकाओं की उपस्थिति के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया था। यह बाद में संयोजी ऊतक पाचन के लिए पहले एपिडर्मिस को हटाने के स्वतंत्र था। इन contaminants आम तौर पर और अधिक तेजी से proliferated है और इस प्रकार अंत में LEC के अलगाव को दोहराने के लिए बाद के प्रयासों के बावजूद endothelial सेल संस्कृतियों overgrew। दरअसल, 5% से 2% तक कम गैर endothelial कोशिकाओं की एक शुरुआती संदूषण LEC आबादी 15 डूब करने के लिए पर्याप्त था। इस LEC सेल उपज और शुद्धता में सुधार करने के लिए एक विकल्प के रूप में fluorescently सक्रिय सेल छँटाई विधि का पता लगाने के लिए हमें प्रेरित किया। इसके अलावा, हम CD34 कम CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति LECs की पहचान करने के लिए चयन मार्करों के लिए VEGFR -3 और PODOPLANIN, उनका कहना है LEC आबादी की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए छँटाई मल्टी पैरामीटर का इस्तेमाल किया।
इन मार्करों के चयन के लिए तर्क रिपोर्ट के आधार पर किया गया था कि LECs और रक्त संवहनी endothelial सीई, जबकिरक्त संवहनी endothelial कोशिकाओं 21-23 की तुलना में जब LLS ऐसे CD31 के रूप में आम में कई कोशिका की सतह मार्करों है, LECs CD34, PODOPLANIN और VEGFR -3 कोशिका की सतह मार्कर की उनकी अभिव्यक्ति में प्ररूपी भिन्नता दिखा। CD31 भी प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु 1 (PECAM-1) के रूप में जाना जाता है एक 130 केडीए ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन है। ऐसा लगता है कि रक्त और लसीका वाहिकाओं 21,24,25 के सभी प्रकार पर व्यक्त की है के बाद से एक अखिल endothelial सेल मार्कर माना जाता है। CD34 सबसे हिमेटोपोयटिक पूर्वज पर 110 केडीए ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन मौजूद है और कोशिकाओं, संवहनी endothelial कोशिकाओं और कुछ लसीका वाहिकाओं 26 स्टेम।
VEGFR -3, संवहनी endothelial वृद्धि के लिए रिसेप्टर, सी और डी कारकों माउस भ्रूण में विकसित करने नसों पर शुरू में मौजूद है, लेकिन प्रतिलेखन द्वारा विनियमित लसीका विनिर्देश निम्नलिखित (sox) -18, सी hicken sry से संबंधित एचएमजी बॉक्स कारकों ओ valbumin यू के pstreaएम पी romoter टी ranscription च अभिनेता 2 (COUPTF-द्वितीय) और प्रोक्स -1, VEGFR -3 शिरापरक अभिव्यक्ति खो दिया है और यह भ्रूण LECs 25,27 तक ही सीमित हो जाता है। PODOPLANIN, एक 38 केडीए झिल्ली mucoprotein, पहली माउस भ्रूण के विकास के लिए 28 के लगभग भ्रूण लसीका वाहिकाओं दिन 11 (~ E11.0) पर ध्यान दिया जाता है और यह दृढ़ता से माइक्रोवैस्कुलर लसीका वाहिकाओं, लसीका विकृतियों में macrocystic लसीका अन्तःचूचुक द्वारा PODOPLANIN अभिव्यक्ति द्वारा व्यक्त की गई है जबकि 15 और चर रहा है। प्रयोगों के कम से कम कुछ CD34 उच्च CD31 स्थिति endothelial कोशिकाओं लसीका मार्कर PODOPLANIN 29 व्यक्त सुझाव है कि प्रवाह cytometry। मानव लसीका विकृतियों में LYVE -1 और PODOPLANIN धुंधला की व्यवस्थित मूल्यांकन दोनों LYVE-1 प्रारंभिक लसीका में मजबूती से उपस्थित होने की सूचना मिली थी, सामान्य ऊतकों में, लसीका कुरूपता अन्तःचूचुक 30 धुंधला में प्रभावी रहे हैं पता चला है कि यद्यपिकेशिका अन्तःचूचुक लेकिन कम और एकत्रित लसीका अन्तःचूचुक 31 में भी अनुपस्थित। हमारा उद्देश्य अलग करने के लिए है के रूप में हम दोनों का विकल्प चुना है प्रारंभिक और एकत्रित लसीका endothelial कोशिकाओं हमारे सेल चयन की रणनीति के हिस्से के रूप में LYVE-1 उपयोग करने के लिए नहीं। अंत में, इन मार्करों को रोजगार के लिए निर्णय भी सूक्ष्म इमेजिंग के लिए लसीका वाहिकाओं लेबलिंग के लिए diagnostically इस्तेमाल कर रहे हैं कि एंटीबॉडी की उपलब्धता, प्रवाह cytometry और Immunofluorescent पढ़ाई के बीच संबंध की अनुमति होगी कि एक फीचर पर आधारित था।
यह लेख चमड़ी और लसीका कुरूपता से CD34 कम CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति LECs के सफल अलगाव के रूप में अच्छी तरह से CD34 उच्च CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति endothelial कोशिकाओं के लिए आवश्यक ऊतक पाचन विधि, सेल धुंधला हो जाना और FACS सेटिंग्स का वर्णन करेंगे ऊतक।
Protocol
Representative Results
Discussion
LECs द्रव समस्थिति, विदेशी एंटीजन और अवशोषण और कुछ पोषक तत्वों के परिवहन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। LEC समस्थिति ऐसे जीवाणु संक्रमण और ट्यूमर मेटास्ट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों बेकर फाउंडेशन और Zerina Lokmic के समर्थन रॉयल बच्चों के फाउंडेशन 'विज्ञान फैलोशिप में महिलाओं को स्वीकार करना होगा। एंड्रयू जी Elefanty और एडुअर्ड जी स्टेनली NHMRC वरिष्ठ रिसर्च फैलो हैं। उनके प्रयोगशालाओं में काम NHMRC और स्टेम सेल ऑस्ट्रेलिया द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Description |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 | |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
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